黄州近郊两地菜粉蝶酯酶多态性分析

吴中华，徐 曼，冯清雪，雷桂兰

(1.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000；2.黄冈师范学院 经济林木种质改良与综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄州 438000；3.黄冈师范学院 大别山特色资源协同创新中心，湖北 黄州 438000)

黄州近郊两地菜粉蝶酯酶多态性分析

吴中华1,2,3，徐 曼1，冯清雪1，雷桂兰1,2,3

(1.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000；2.黄冈师范学院 经济林木种质改良与综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄州 438000；3.黄冈师范学院 大别山特色资源协同创新中心，湖北 黄州 438000)

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对黄州近郊长祈廖(CQL)和万福(WF)两蔬菜种植地的菜粉蝶的酯酶同工酶进行研究。实验结果显示：两地菜粉蝶成虫酯酶酶谱分三个电泳酶带区，共显示了23条酶带； CQL种群多态性酶带21条，多态性比例为91.3%；WF种群多态性酶带19个，多态性比例82.6%；两种群非多态性酶带Rm值和出现频率不相同。研究表明黄州近郊两地菜粉蝶种群酯酶多态性存在差异，推测它们遗传多样性可能存在差异。该研究结果对黄州近郊菜青虫治理有指导作用。

菜粉蝶；酯酶同工酶；代谢抗性

菜粉蝶[Pierisrapae(linnaeus)]为鳞翅目、粉蝶科昆虫，又名菜白蛾、白粉蝶等，幼虫叫菜青虫。菜青虫是危害农作物的主要虫态，广布于全国，是危害白菜、甘蓝等十字花科植物的严重普发性害虫，在春夏秋三季往往给菜农带来较为严重的经济损失[1-2]。为治理菜青虫，农民曾大量使用低毒的有机磷杀虫剂杀虫。近年来，国家明令禁止蔬菜上喷施有机磷农药，农民转而大量使用拟除虫菊酯治虫。化学杀虫剂的大量使用，导致害虫抗性逐年增加，抗性机理主要涉及由解毒酶的代谢能力增强而引起的代谢抗性以及由杀虫剂作用靶标部位敏感性降低而引起的靶标抗性，主要集中于对代谢抗性的分子机理，包括在抗性昆虫中与三大解毒酶系：细胞色素P450单加氧酶(P450s)、酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)相关的基因扩增，过量表达和基因突变有关[3-5]。

黄州区是黄冈市市府所在地，市区东南和西北两端近郊分布有供应本市蔬菜的种植基地，为了解黄州近郊菜青虫对化学农药抗性，拟开展菜粉蝶酯酶多态性研究，旨在为黄州近郊蔬菜基地菜青虫治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验用菜粉蝶成虫分别采集黄州区东湖办事处长祈廖社区(简称长祈廖种群，CQL)和禹王办事处万福村(简称万福种群，WF)，活的菜粉蝶成虫样本置-20℃冰箱保存。

1.2 化学试剂与仪器

实验用化学试剂乙酸-α-萘酯(AR)、乙酸-β-萘酯(AR)、三羟甲基氨基甲烷(CP)，丙烯酰胺(AR) 甲叉双丙烯酰胺(AR) 四甲基乙二胺(AR)，甘氨酸(AR)、固蓝B(生化试剂，进口分装)等均由武汉科瑞生物技术有限公司提供。

实验仪器：DYY-12C型电脑三恒多用电泳仪，由北京六一仪器厂生产。

1.3 方法[5-8]

1.3.1 电泳方法

采用高pH不连续凝胶系统，浓缩胶质量分数为4.5% , pH= 6.7,分离胶质量分数为7.5%，电极缓冲液为Tris-Gly，pH= 8.3。

1.3.2 点样及电泳

以个体为单位，取成虫腹部加0.2 mL样品提取液(0.1 mol·L-1Tris·HCL, TritonX-100质量分数 0.1%，pH7.0) ，冰浴研磨, 在4℃，10 000rpm下，离心10 min，取上清液备用，每个样本取成虫个数约26个。浓缩胶电压90 V ，待指示剂进入分离胶后，调电压至110 V ,电泳约6 h。

1.3.3 染色

取 2%乙酸-α-萘酯、2%乙酸-β-萘酯各1 mL于小烧杯中混合，然后加入40 mg固蓝B溶解，加入40 mL 磷酸-F-缓冲液混匀倒入装有聚丙烯酰胺凝胶胶片的瓷盘中，室温下置于摇床上孵育直至显出清晰的酯酶特征条带，倒掉显色液，用清水冲洗，然后加入适量的固定液过夜，拍照保存实验结果。

2 结果与分析

采用聚丙酰胺凝胶电泳法分别检测了黄州近郊长祈廖种群(CQL)和万福种群(WF)菜粉蝶酯酶多态性，CQL和WF种群酯酶分析成虫各26只，两种群酯酶酶谱见图1、2，酯酶多态性数据见表1、2。

从图1、2可以看出，菜粉蝶成虫酯酶按照分子量大小，大约分三个电泳酶带区，分别是EST-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ区，依据酶谱酶带迁移率(Rm)一共显示了23条酶带，酶带迁移率见表1、2。从图上还可以看出Ⅱ和Ⅲ区的酶带丰富度高于Ⅰ区，Ⅱ和Ⅲ区酶带染色深说明酶活也高于Ⅰ区或酯酶过量表达。CQL种群电泳共获得144条酶带，WF种群电泳共获得148条酶带，单个成虫显示2～9条酶带，平均5～6条酶带(表3)；CQL种群超过6条酶带的个体6只，占23%，若将酶带出现频率<50%定为多态性酶带，CQL种群多态性酶带21条，多态性比例为91.3%，非多态性酶带Rm值是：0.2和0.47，出现频率分别是57.7%与50%；WF种群超过6条酶带的个体8只，有三个个体酶带为9条，占31%，多态性酶带19条，多态性比例82.6%，非多态性酶带Rm值是：0.025、0.23、0.25和0.44，出现频率分别是57.7%、57.7%、73.1%和50%。对两个种群酯酶多态性分析结果显示，种群间高酶带数量个体、多态性酶带比例、非多态性酶带位点数及Rm存在差异，说明黄州近郊菜粉蝶种群酯酶多态性存在差异，推测它们遗传多态性可能存在差异。

图1 长祈廖种群成虫酯酶电泳染色结果

酶带EST-Ⅰ区EST-Ⅱ区12345678910111213迁移率/%0．0250．040．070．080．10．120．140．160．180．20．230．250．28CQL频率/%2319．27．73．815．43．8232346．257．738．534．63．8WF频率/%57．7-7．711．53．87．73．811．515．434．657．773．126．9

表2 菜粉蝶成虫酯酶同工酶酶带出现频率(EST-Ⅲ区)

表3 菜粉蝶成虫酯酶同工酶酶带数量

图2 万福种群成虫酯酶电泳染色结果

3 讨论

酯酶(esterase)是催化酯键水解的一大类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。许多酯酶都是由多基因家族编码的，在物种和亚种之间酯酶同工酶存在差异，因此是进化关系分析和品种鉴定的重要靶酶。郭晓霞等(2002年)[8]对菜粉蝶不同发育期酯酶同工酶的比较研究，检测出酯酶酶带21条，按Rm值将酶带分为三个区，各发育期酶谱具有一定相似相异性，说明菜粉蝶基因表达与不同时期食性有关。比对郭晓霞等研究结果，笔者认为黄州近郊两地菜粉蝶酯酶酶谱与其具有一致性，但成虫的酶带数量和分区存在差异，说明两地种群遗传背景不同。造成黄州近郊两种群酯酶多态性变化的原因，可能是所处环境差异不同影响的结果。许多文献报道[3-5]水解羧酸酯键、磷酸酯键的酯酶在有机磷和拟除虫菊酯等杀虫剂的代谢中起着重要作用，在抗性机理中具有双重作用，即通过结合和/或水解杀虫剂发挥解毒作用。在抗性昆虫中，酯酶的活性提高主要是酯酶基因扩增使得表达量的增加或活性并不提高但催化效率提高所引起。对黄州近郊两地CQL和WF种群酯酶电泳结果进行对比分析发现，两种群的EST-Ⅱ区、EST-Ⅲ区酶带数量、酶活大小基本呈一致性，成虫高酶活酶带数量多，说明两种群成虫个体对化学杀虫剂具有高抗性；但种群间高酶活酶带的个体数量和Rm有差异，说明两地环境不同如使用化学农药的种类和频率有差异，导致其酯酶遗传多样性不同；虽然，长祈廖和万福地理距离仅仅十几公里，两种群间成虫会通过迁飞交流，但这种交流被城市所阻隔，这也是造成酯酶多样性的另一原因。总而言之，黄州近郊菜粉蝶对化学农药具有一定的抗药性，在害虫治理上建议使用低毒的、混配的农药，尽量多使用生物农药，减少化学农药的使用，让当地市民吃上放心的蔬菜。

[1] 陈晓宁,仝怡.菜粉蝶研究综述[J].自然科学,2010,1:4-5.

[2] 黄逸钗.菜青虫综合防治技术[J].福建农业科技,2012,Z1:90-91.

[3] 周斌芬,唐振华,高菊芳.昆虫代谢抗性研究进展[J].农药,2008,47(5):313-315,323.

[4] 王志超,康志娇,史雪岩,等.有机磷杀虫剂代谢机制研究进展[J].农药学学报,2015,17(1):1-14.

[5] 吴中华,燕帅国,林立丰,等.不同地理种群尖音库蚊复组抗性动态和遗传多样性[J]. 昆虫学报,2009,52(05):522-530.

[6] 胡能书,万贤国.同工酶技术及其应用[M].长沙:湖南科技出版社,1985,l-135.

[7] 孙玉梅,王敦清.蜣螨酯酶同工酶的比较研究[J].昆虫学报,1988,31(4):401-406.

[8] 郭晓霞,郑哲民.菜粉蝶不同发育期酯酶同工酶的比较研究[J].昆虫学报,2002,45(3):401-403.

责任编辑 喻晓敏

A study on esterase isozymes of two population Pieris rapae in the suburbs of Huangzhou

WU Zhong-hua1,2,3, XU Man1, FENG Qing-xue1, LEI Gui-lan1,2,3

(1.College of life science, Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China;2.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization,Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China 3.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China)

The polyacrylamide gel electrophoresis technology was used to study the esterase isoenzyme ofPierisrapaebetween two different vegetable planting area, Changqiliao(CQL)and Wanfu(WF), which were both in the suburbs of Huangzhou. The results showed that there were totally 23 bands distributed in three electrophoresis bands area from the esterase pattern of two populationPierisrapae. 21 and 19 esterase bands were found in population CQL and WF, from which the ratios of polymorphism were 91.3% and 82.6% respectively. In addition, the RM value and occurrence frequency of non-polymorphism esterase bands in two population were different. We estimate that the genetic diversity may exist in those two populationPierisrapae. Our study can provide important guidance for the prevention and control of Pieris rapae in the suburbs of Huangzhou.

Pierisrapae; esterase isozymes; metabolic resistance

Q38

A

1003-8078(2016)06-0034-03

2016-10-30 doi 10.3969/j.issn.1003-8078.2016.06.10

吴中华,男,湖北黄州人，教授,主要研究方向为农业害虫抗性遗传与治理。

雷桂兰,女,湖北黄州人，高级实验师,主要研究方向为动物遗传学。

湖北省教育厅自然科学研究项目(2012001402);黄冈师范学院科学研究项目(06ca22)。