市县级兽医实验室布鲁氏菌病诊断方法的比较

罗占华，刘秋

（1.湖南省常德市鼎城区畜牧兽医水产局，湖南常德415000；2.湖南省常德市畜牧兽医水产局，湖南常德415000）

市县级兽医实验室布鲁氏菌病诊断方法的比较

罗占华1，刘秋2

（1.湖南省常德市鼎城区畜牧兽医水产局，湖南常德415000；2.湖南省常德市畜牧兽医水产局，湖南常德415000）

布鲁氏菌病，是由布鲁氏菌引起的人畜共患病，属于二类动物疫病，对人类健康和畜牧业发展具有很大危害。针对市县级兽医实验室常用的虎红平板凝集试验、试管凝集试验与世界动物卫生组织（OIE）推荐使用的ELISA试验进行比较，文章分析三者在市县级兽医实验室的诊断意义。结果显示，CELISA在敏感性和特异性均优于试管凝集试验、虎红平板凝集试验。笔者认为虎红平板凝集试验适合大量样本的初筛，ELISA比试管凝集试验更适合在我国市县级兽医实验室布鲁氏菌病大量样本监测、诊断中推广应用。

布鲁氏菌病；诊断方法；市县级兽医实验室

布鲁氏菌病（以下简称布病），是由布鲁氏菌侵入机体而引起的人畜共患性全身传染病。布病的主要临床症状为雌性动物的流产、繁殖能力下降；雄性动物的睾丸炎和附睾炎。人常表现为持续性感染、间歇性流感样的症状，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等，严重者失去劳动力[1]。国内市县级兽医实验室主要采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验等传统布病抗体检测技术。施自更等研究表明，虎红平板凝集试验与试管凝集试验都会出现一定的假阳性及假阴性。由于试管凝集试验的检测结果不理想，OIE于2000年宣布不主张将其用于国际贸易[2]。市县级兽医实验室是监测布鲁氏菌病的主体，为了市县级兽医实验室获得最适合的诊断布鲁氏菌病的方法，作者对三种方法进行了认真的比较。

1 材料

1.1 试剂

布病试管凝集试验抗原，由青岛立见诊断技术发展中心生产；布鲁氏杆菌竞争酶联法抗体诊断试剂盒，由瑞典Svanova公司生产；虎红平板凝集试验抗原、阴性血清、阳性血清，由兰州兽医研究所生产。

1.2 血清

阴性血清2份，阳性血清10份(每份阳性血清倍比稀释,稀释倍数分别为1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍)。

1.3 仪器

酶标仪（型号：mk3），由美国Thermo公司生产。

2 试验设计

通过虎红平板凝集试验、试管凝集试验、CELISA方法进行检测不同浓度的阳性血清、阴性血清，比较三种方法结果的准确性，达到为市县级兽医实验室筛选出适合的布鲁氏菌病诊断方法。

2.1 布鲁氏菌病试管凝集试验（SAT）

2.1.1 试管凝集抗原在使用前用生理盐水10倍稀释。

2.1.2 将待检血清做1:12.5、1:25、1:50、1:100稀释。具体方法是：第一个管先加入2.3 mL石碳酸生理盐水，以后每管都加入0.5 mL石碳酸生理盐水，向第一个试管加入0.2 mL血清混匀后取0.5 mL加到第二个试管中作1:1稀释。以后各管类推。第一个试管应弃去1.5 mL稀释血清。

2.1.3 将稀释10倍的布鲁氏菌菌液0.5 mL分别加入各个血清试管内，摇匀，放37℃24 h观察结果。最后血清的稀释度为1:25、1:50、1:100、1:200。

2.1.4 比浊管设定：比浊管编号及设定见表1。

表1 SAT比浊管对照

2.1.5 结果判定：每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，在对照成立的前提下判定结果。待检羊血清效价在1:50（++）以上者为阳性；1:25（++）为可疑，以下为阴性。

2.2 瑞典Svanova-C ELISA

2.2.1 将试剂盒恢复到室温。

2.2.2 加入10倍稀释的待检血清和标准对照血清，50 μL/孔。

2.2.3 在对照和检测样品的所有孔内加入单抗溶液，50 μL/孔，室温孵育30 min。

2.2.4 用PBST清洗4次。

2.2.5 每孔加入100μL交联物溶液，室温孵育30min。

2.2.6 用PBST清洗4次。

2.2.7 每孔加入100 μL TMB底物溶液，室温条件下孵育10 min。

2.2.8 加入终止液50 μL/孔，终止反应。

2.2.9 450 nm读取OD值。

公式计算抑制率（PI）：抑制率（%）=100－OD样品／ODcc×100%。

结果判定：PI≥30%判定为阳性，PI＜30%判定为阴性。

2.3 虎红平板凝集试验（RBPT）：

取0.03mL待检血清，滴于洁净的玻璃板上，然后取等体积虎红平板凝集抗原与血清充分混匀，室温作用。结果判定：在4min内判定结果。任何程度的凝集均为实验阳性，完全不凝集为阴性，同时做阴阳性对照。

3 结果

通过三种诊断方法的结果比较得出，虎红平板凝集试验、试管凝集试验、CELISA与真实值的符合率分别为88.9%、81.9%、95.8%（详见表2）。

表2 各血清组检测结果比较

4 结论

我国市县级兽医实验室仪器设备简单，从业人员素质较低等因素决定我们市县级兽医实验室实用的布鲁氏菌病诊断方法必须结果准确、易于操作。王秀丽等的研究表明IELISA方法灵敏度比SAT、PRBT高60～150倍[3]，与本试验的结果一致。结合国内外专家学者的研究成果，笔者认为虎红平板凝集试验适合大量样本的初筛，ELISA适合在我国市县级兽医实验室布鲁氏菌病大量样本监测、诊断中推广应用，而试管凝集试验应该与国际接轨，不主张其作为该病确诊的方法。

[1]闻玉梅.现代微生物学[M].上海:上海医科大学出版社,1999:455-469.

[2]施自更,顾祥国,江欲吉.奶牛两病检测操作的改进与创新措施[J].浙江畜牧兽医,2012,(4):15-16.

[3]王秀丽,蒋玉文,毛开荣,等.布鲁氏菌病实验室诊断方法的研究进展[J].中国兽药杂志,2011,(11):37-42.

S855.12；S854.43

B

1006-4907（2016）05-0046-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.019

2016-09-22

罗占华（1971～），女，汉族，大专，助理兽医师，主要从事动物疫病监测，cdsxmk@163.com。