复方淫羊藿对多杀性巴氏杆菌感染小鼠保护作用研究

胡长青

（湖南省宁乡县动物疫病预防控制中心，湖南宁乡410600）

复方淫羊藿对多杀性巴氏杆菌感染小鼠保护作用研究

胡长青

（湖南省宁乡县动物疫病预防控制中心，湖南宁乡410600）

为了探究复方淫羊藿对猪多杀性巴氏杆菌感染动物的保护作用，将复方淫羊藿作为饲料添加剂按0.05%、0.1%、0.15%添加到鼠饲料中，饲喂3周龄昆明白小鼠30d。对小鼠进行碳粒廓清试验，溶菌酶活性及对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠保护试验。结果显示，复方淫羊藿能够提高免疫器官指数，增加了单核-巨噬细胞的活性，显著提高了溶菌酶活性，增强了机体免疫力，从而达到了对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用。

复方淫羊藿；多杀性巴氏杆菌；保护作用

中国是世界上最重要的生猪养殖和猪肉消费大国，拥有悠久的养猪传统。多杀性巴氏杆菌病是猪场常见病之一，目前主要使用疫苗预防该病，但是该菌分布广泛，血清型多，致使免疫效果不佳。笔者根据现代中药药理学研究表明“滋补”类中药都具有一定的免疫增强作用，根据中药配伍原则和组方理论，将性能相关的中药配合应用，筛选和优化经验配方得到淫羊藿、女贞子、白术、茯苓四味中药组成“复方淫羊藿”作为免疫增强剂饲喂小白鼠，考察其对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠的保护作用及其机理[1]，取得较为满意的效果。现将试验情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

本研究中使用的猪多杀性巴氏杆菌（菌株为PM-C439），购自北纳创联生物技术研究院。

1.1.2 实验动物

80只3周龄和60只8周龄SPF级昆明白雄鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于湖南农业大学动物医学楼动物房。饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28℃，湿度为（50±10）%。动物饲养适应3天后进行试验。

1.1.3 主要试剂

淫羊藿、女贞子、白术、茯苓四种药材均采购于养天和大药房湖南农大店。

印度墨水，购自北京索莱宝科技有限公司。溶菌酶检测试剂盒（比浊法），购自南京建成生物工程研究所。TSB液体培养基自配，购自青岛海博生物技术有限公司；小牛血清，购自浙江天杭生物科技股份有限公司；在3%的TSB溶液中加入小牛血清，配成含5%CS（V/V），3%TSB（M/V）的液体培养基。巧克力色琼脂糖培养基，购自贝瑞特生物科技（郑州）有限公司。

1.1.4 主要仪器

恒温水浴锅（型号:HHW-420-600），由国旺实验仪器厂生产；紫外分光光度计（型号:UV-3000），由北京莱伯泰科仪器有限公司生产；台式离心机（型号:5810R），由德国Eppendorf公司生产；不锈钢立式电热蒸汽压力灭菌器（型号:LDZX-40），由上海甲安医疗器械厂生产；生化培养箱（型号: LRH-150B），由广东省医疗器械厂生产；超净工作台（型号:SW-CJ-IC），由苏州安泰空气技术有限公司生产；酶标仪（型号:M200 PRO），由瑞士TECAN公司生产。

1.2 方法

1.2.1 复方淫羊藿饲料的制备

以药材的10倍水量采用水提法提取复方淫羊藿药液，送与湖南斯莱克景达实验动物有限公司制备成含复方淫羊藿0.05%、0.1%、0.15%（w/w）的鼠饲料。

1.2.2 动物分组及处理

将80只3周龄昆明白小鼠随机分成4组，每组20只，分别饲喂添加了高、中、低3个剂量的复方淫羊藿鼠饲料和普通饲料，连续饲喂30 d。60只7周龄昆明白小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定。

1.2.3 碳粒廓清试验

每组随机取10只小鼠，经行称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉注入0.1 mL/10 g的印度墨汁（生理盐水稀释6倍），注射后分别在2 min（T1）、7 min（T2）乙醚麻醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20 μL，溶于20 mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，静置20 min后每个样品取100 μL加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以0.1%溶液为空白对照，使用酶标仪在680 nm波长测量其OD值。将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数Ka值及免疫器官指数。计算公式：

注：M=体重，M1=肝脏重，M2=脾脏重，A为吸光光度值

1.2.4 溶菌酶活性的测定

每组剩下的10只小鼠采用眼眶静脉丛采血约0.6 mL，4℃冰箱静置保存2 h后分离血清，按说明书检测溶菌酶(LZM)活性。

取200 μL的待测血清、溶菌酶标准液（0.1 mg/mL∶200 IU/mL）作为阳性对照、双蒸水（空白样），分别加入2.0 mL微球菌菌液（0.25 mg/mL），立即混匀，37℃水浴15 min，按时取出置于0℃的冰水浴中3 min。530 nm，1 cm光径，以蒸馏水调透光度100%，测定各管的透光度。计算公式：

溶菌酶含量（IU/mL）=（测定管透光度-对照管透光度）/（标准管透光度-对照管透光度）×2000 IU/mL

1.2.5 猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定

将菌株PM-C439在加有5%犊牛血清的TSB培养基在37℃恒温摇床上180 r/min培养10 h，将细菌依次10倍稀释，分别取10 μL涂于巧克力平板培养后计数；同时将上述10倍稀释的菌液分别腹腔注射（100 μL/稀释浓度）小鼠，每个浓度处理10只7周龄的昆明白小鼠，采用6个浓度。每天观察并记录小鼠死亡情况，连续观察4天。小鼠半数致死量的计算按Reed和Muench氏法。

计算公式：距离比例=（高于50%的死亡百分数-50%）/（高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数）；LD50的对数（LgLD50）=死亡率高于50%的对数+距离比例×稀释系数的对数。

1.2.6 对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用

将进行溶菌酶活性测定的小鼠饲喂3天，待其恢复健康后，腹腔注射1 000个LD50菌液（100 μL）进行攻毒，每天观察小鼠状态并记录死亡情况，连续观察4 d。

1.3 数据分析

数据使用平均值±标准差（SD）表示，使用SPSS 17.0软件以单因素变异数分析进行组间差异显著性检验，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫器官指数测定结果

饲喂添加复方淫羊藿饲料的小鼠免疫器官指数相对于对照组略有提高（表1），其中肝脏指数组方低添加组提高最大为5.23%，脾脏指数提高最多的组方中的33.3%，肝脏指数与脾脏指数不呈同步增长。

表1 小鼠免疫器官指数

2.2 碳粒廓清试验测定结果

如表2所示饲喂添加复方淫羊藿饲料小鼠的校正廓清指数Ka有所提高，组方大提高最明显（相对于对照组提高了14.63%），说明单核-巨噬细胞的吞噬活性有所提高。

表2 碳粒廓清试验结果

2.3 血清溶菌酶活性测定结果

从实验结果来看，饲喂添加复方淫羊藿饲料后小鼠血清中溶菌酶活性显著提高（P＜0.05），其中组方大小鼠溶菌酶活性提高率达到了62.64%。

图1 血清溶菌酶活性测定结果

2.4 猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定

菌株PM-C439在37℃培养10 h后，将细菌10倍稀释涂布巧克力平板，计数得到菌落数为4.3× 1011个细菌/mL。小鼠死亡情况如表3所示，稀释倍数为10-5～10-3处理小鼠，在3 d内全部死亡；加大稀释浓度有不同程度死亡。根据Reed和Muench氏法计数得到LD50=10-6.5，即为：4.3×1011（菌液浓度）×10-6.5×10-1(注射量为0.1 mL)=4.3×103.5细菌数。

表3 小鼠半数致死量（LD50）的测定

2.5 对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用试验

小鼠攻毒后在24 h内有狂躁不安的表现，随后精神萎靡，被毛凌乱，畏冷，食欲废绝，少数出现摆头的神经症状。从图2可以看出，小鼠死亡主要集中在第3天，对照组只存活1只小鼠，而饲喂添加复方淫羊藿饲料后小鼠的存活率大大提高了，在第3天分别为组方小存活4只，组方中存活5只，组方大存活了5只。直至第5天，对照组仅存活一只，其他组分别存活了2只、3只、4只。

图2 攻毒后小鼠的存活情况

3 讨论

此次研究发现复方淫羊藿作为饲料添加剂可以通过提高免疫器官指数，增加了单核-巨噬细胞的活性，显著提高了溶菌酶活性，从而达到了对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用，其中的机理可能于各个组分的有效成分的作用有关。

现代中医药学研究发现，本方剂中的主药淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿作用，其主要化学成分为黄酮类化合物，淫羊藿经口给药发挥主治功效的物质基础主要为其代谢产物，如淫羊藿素、去甲淫羊藿素和朝藿定A等[2]。淫羊藿苷可以提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,并能使受到环磷酰胺损伤以及电离辐射的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能恢复至正常水平,还可以通过影响巨噬细胞因子的分泌而调节免疫机能。淫羊藿同样能促进B淋巴细胞的增生和转化,提高抗体生成水平[3]。

女贞子中的红景天苷及其苷元酪醇具有提高机体免疫功能、抗炎抑菌、升高白细胞、降血糖、调血脂等功效[4]。女贞子多糖对小鼠的免疫作用与机体的免疫状态有关,对非特异性细胞免疫有增强作用,对正常小鼠的特异性细胞免疫无显著影响,对免疫抑制状态小鼠的细胞免疫有增强作用[5]。白术具有提高机体抗病能力、保肝利尿，抗菌等作用[6]；茯苓主要成分有茯苓多糖和茯苓素，具有保肝利尿、免疫调节、抗炎、抗病毒、抗氧化等多种药理作用[7]。

四种“滋补”药物的配伍使用，更是发挥了相须相使的作用，提高了药效，减少了用药量，达到了较好的保护作用。复方淫羊藿方剂有望作为一种有效的预防猪多杀性巴氏杆菌的饲料添加剂运用到养殖业中。

[1]赵迎虎.复方中药免疫增强剂“增康灵”对动物免疫功能的影响[D].湖南农业大学,2010.

[2]韩惠，单淇，周福军，等.淫羊藿中活性成分的代谢产物研究进展[J].现代药物与临床,2013,28(1):78-82.

[3]赵文静,王历,王芝兰,等.淫羊藿的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息,2016,33(2):105-108.

[4]程敏，胡正海.女贞子的生物学和化学成分研究进展[J].中草药，2010,41（7）:1219-1221.

[5]于东波,张宏方,郑玉,等.女贞子对免疫相关调节作用研究进展[J].中国中医药现代远程教育,2016,14(7):150-151.

[6]王瑞娜，唐茜，何凤发.药用白术的药理作用及其综合开发利用[J]安徽农业科学,2010,38(11):5610-5611.

[7]梁学清，李丹丹，黄忠威.茯苓药理作用研究进展[J].河南科技大学学报(医学版),2012,30(2):154-156.

S816.7

A

1006-4907（2016）05-0043-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.018

2016-08-29

胡长青（1974～），男，汉族，专科，助理兽医师，主要从事动物防疫工作，E-mail：252421564@qq.com.