线粒体与体细胞核移植

贾晓，程艳，曾溢滔

线粒体与体细胞核移植

贾晓，程艳，曾溢滔

1996 年克隆羊“Dolly”在英国诞生。此后，体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术广泛应用于克隆动物和转基因动物研究，迄今已有 10 多种不同物种的克隆动物相继问世。然而，克隆效率偏低以及克隆动物表征缺陷是一直存在的问题。核质的互作与协调是所有细胞正常活动的基础，克隆胚重编程和正常核型的维持取决于供体核与受体卵母细胞的同步协调和相互作用[1]。作为细胞能量来源的线粒体是哺乳动物细胞中唯一具有自身遗传物质的细胞器，其正常功能的行使受到核基因组和线粒体基因组的共同调控。在核移植实验中，卵母细胞的线粒体 DNA（mitochondria DNA，mtDNA）与供体细胞的核 DNA 能否有效地协同工作是影响核基因组重编程效率的一个重要因素。mtDNA 在不同物种之间、同一物种不同个体间均存在大量的核苷酸差异，这种由 mtDNA 多态性产生的不同mtDNA 单倍型也可导致种内核－线粒体互作产生不同效应。此外，克隆胚胎中，存在受体卵母细胞和供体细胞两种来源的线粒体，这两种线粒体的相互作用影响着重构胚的发育。本文对 SCNT 中线粒体的功能与特性以及两种来源的线粒体的异质性及其对克隆效率和重构胚发育的影响进行综述和讨论。

1 SCNT 中的线粒体生物学

在哺乳动物细胞中，线粒体为细胞的生命活动提供能量。线粒体内膜有一系列酶组成传递电子并产生能量的结构，即呼吸链酶复合体，呼吸链产生的能量供给 ADP 与无机磷酸合成 ATP，这一过程称为氧化磷酸化。线粒体通过呼吸链和氧化磷酸化的偶联来产生并供给能量。线粒体含有自身的遗传物质—— mtDNA。mtDNA 呈双链环状，大小约为 16.5 kb，共有 37 个编码基因，呼吸链酶复合体中的 13 个蛋白质亚基由 mtDNA 编码，而其他蛋白由核基因编码[2]。mtDNA 和核 DNA 相互协调才能保证线粒体正常供能。

在 SCNT 中，线粒体最基本的功能是为卵母细胞的成熟和克隆胚胎的发育提供能量[3]。研究发现卵母细胞内 ATP供应不足会导致发育缺陷：如染色体分离障碍[4]、细胞分裂中断、卵母细胞成熟失败[5]等。在核移植操作过程中，外界的机械压力导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高，ROS 含量过高会诱发线粒体呼吸链蛋白的编码基因发生突变，从而阻断氧化磷酸化，使线粒体不能正常供能。已有研究报道，与正常胚胎相比，克隆胚胎中H2O2和 OH-自由基的水平较高，线粒体膜电位较低[6]。膜电位是线粒体势能储备的指标。膜电位降低，可引起线粒体膜内外一系列的生化变化，如诱导细胞色素 C 释放，活化caspase 蛋白酶家族，呼吸链与氧化磷酸化失偶联，三磷酸腺苷合成停止，线粒体膜通透性改变，释放凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡[7]。Bae 等[8]在牛核移植操作过程中用抗氧化剂处理受体细胞和重构胚发现 H2O2水平下降，线粒体膜电位增高，克隆胚的损伤减少，保证了后续胚胎发育的正常进行。克隆胚胎中损伤线粒体的增多会导致胎盘凋亡以及凋亡基因 BCL2 和 BAX 的异常表达[9]。因此，SCNT 中线粒体结构和功能的完整性至关重要。

2 SCNT 中线粒体与供体核相容性的研究

核质的互作与协调是细胞正常活动的基础，体细胞核移植重构胚正常核型的维持和核基因组重编程的完成，同样取决于供体核与受体卵母细胞的同步协调和相互作用。核质互作是一个复杂的生物过程，与两者的功能状态及其相互作用是否符合细胞的发育规律有关，涉及供核细胞的类型、所处的细胞周期以及卵母细胞的成熟质量和处理方式等多个因素。研究发现使用卵胞质抽提物预处理供体细胞可以显著提高核移植胚胎囊胚率，推测卵胞质抽提物改变了供体核的结构，增加了供体核与卵胞质中重编程因子的相互协调作用使得受体卵母细胞更容易重编程供体核[10]。Enright 等[11]用一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂古曲霉素 A（TSA）处理供体细胞，发现 TSA 可增加供体核的组蛋白乙酰化水平，促进发育相关基因的表达，提高克隆囊胚率。

线粒体作为哺乳动物细胞中唯一具有自身遗传物质的细胞器，不仅参与能量供应，而且可以通过 mtDNA 合成自身功能相关的部分蛋白质，同时又受到核的调控，参与线粒体合成及功能行使的蛋白质中，大约有 1500 种由核基因编码[12]。线粒体正常功能的行使受到核基因组和线粒体基因组的共同调控，是研究核质互作的良好材料。已有研究指出线粒体与核编码产物不相容性可能是异种体细胞核移植失败的重要原因。在异种体细胞核移植中，羊、猴、猪和大鼠的体细胞移植到去核牛卵母细胞中，经融合后可以支持重构胚的早期发育，但是移植到代孕动物后不能着床[13]。很可能因为早期重构胚中母源性线粒体可以暂时独立供应ATP，而在稍后的发育阶段，不同物种的核基因组与 mtDNA不能很好地兼容，核基因组无法指导母源性 mtDNA 复制和转录，组装新的氧化磷酸化复合物和合成 ATP，从而导致发育失败。因此，供体核和受体卵胞质的相容性对于核正确重编程和克隆胚的发育至关重要。

mtDNA 处于高氧坏境，并且缺乏 DNA 损伤修复机制，因此其突变率远高于基因组 DNA[14]。这种高突变率导致不同种群之间，以及同一种群的不同个体之间的 mtDNA存在多态性位点。根据 mtDNA 的多态性位点可将其划分为不同的单倍型。单倍型是指使用特定限制性内切酶酶切特定 DNA 片段后产生的特定酶切片段格局。mtDNA 单倍型的不同，反映 mtDNA 基因组的差异，不仅能引起生物性状包括体重、耗氧量、ATP 含量、卵子质量、产奶量及生育能力[15]等差异，还会影响体外胚胎生产（IVP）的效率[16]，以及体细胞核移植（SCNT）的效率[17]。

据此，我们团队应用 PCR-RFLP 技术分析牛 mtDNA的多态性，建立了线粒体分型标准，将牛群区分成 4 种主要的单倍型[17]。我们通过活体采卵（oocyte pick up，OPU）技术，获得单倍型确定的牛卵母细胞，用作受体细胞进行体细胞核移植实验，结果发现不同单倍型的卵母细胞具有不同的发育潜能，并影响克隆的效率。当采用 A 型卵母细胞作核移植的受体细胞时，其融合率和囊胚率均显著高于使用B 型卵母细胞[17]。进一步研究发现 A 型线粒体单倍型的牛卵母细胞中 mtDNA 拷贝数和 ATP 的含量以及 mtDNA编码基因的表达水平均明显高于 B 型单倍型的卵母细胞，这可能就是产生上述不同克隆效果的原因[17]。

在体细胞核移植实验中，供体细胞核与卵母细胞来自同一个体的，称之为“同体克隆”；而两者来自不同个体的，称之为“异体克隆”[18]。我们早期的研究发现同体克隆的效率要明显高于异体克隆，尤其是在 8 细胞以后的发育阶段，同体克隆的囊胚率（38%）明显高于异体克隆（22%）[18]。分析“同体克隆”和“异体克隆”两者的区别：前者的供体细胞和卵母细胞的线粒体单倍型是相同的，或者说是相容的，而后者就不一定相同或相容。为了进一步研究在核移植中供体细胞与卵母细胞线粒体的相容性对克隆效率的影响，我们按照牛卵母细胞和供核细胞的单倍型来配型进行核移植试验，结果发现同型组（卵母细胞和供体细胞的线粒体单倍型相同，即 A-A 或 B-B）的克隆效率，包括囊胚率、怀孕率和活产率均明显高于异型组（A-B 或 B-A）。实验结果还表明，同型克隆组重构胚中的表观遗传修饰，包括组蛋白H3K9 甲基化模式以及重要的胚胎发育相关基因 Oct4、Nanog 和 Sox2 的启动子的甲基化，更接近于正常胚胎发育的水平[19]。

此外，在牛同种内（荷斯坦奶牛或鲁西黄牛）核移植实验中，观察到上述的线粒体单倍型和配型对克隆效率的影响，在亚种间（荷斯坦牛与黄牛之间）核移植中也同样观察到[20]。以上结果说明，卵母细胞与供体细胞线粒体的相容性一方面促进供体细胞核的重编程，另一方面让供体核编码的线粒体相关蛋白及调控因子能够更好地参与卵母细胞胞质中线粒体的组成和调控，从而更好地支持重构胚的发育。

3 SCNT 重构胚中线粒体异质性的研究

哺乳动物通过受精获得的正常胚胎中线粒体具有同质性，即只有卵母细胞来源的线粒体，而精子线粒体在进入卵母细胞之前被一种蛋白水解肽-泛素标记，进入卵母细胞后被卵母细胞中的泛素蛋白酶系统识别并降解[21]。然而，也有报道在小鼠[22]和人类[23]等多个物种中也存在精子线粒体渗漏事件，若后代中精卵两种线粒体的单倍型不同便会造成线粒体的异质性，可能导致自发或选择性流产。

和正常受精产生的胚胎不同，克隆胚胎是通过核移植操作获得的。哺乳动物体细胞核移植主要有两种操作方法：一种是胞质内注射，即将供体核连带部分细胞质注入去核卵母细胞胞质中；另一种是透明带下注射，即将供体细胞直接注入去核卵母细胞的透明带下。无论采用哪种操作方法都不可避免地会将供体细胞的线粒体带入受体卵胞质中，从而使重构胚中存在两种来源的线粒体，导致克隆后代中全部细胞或部分细胞同时存在两种来源的线粒体，形成线粒体异质性[24]。

克隆胚中线粒体的异质性程度与核移植实验的操作方法、供体细胞类型、供体细胞与受体卵母细胞的亲缘关系等多种因素有关。从已有的研究报道来看，在同种内的核移植中，大多后代的线粒体主要来源于核受体[25-27]。这可能由于供体细胞与受体卵母细胞在遗传上亲缘关系较近，核基因编码线粒体复制、转录和翻译的因子能有效地支持受体卵母细胞来源的线粒体的发育，核供体来源的线粒体则经类似泛素化途径得到降解。而在远缘异种核移植的研究中存在两种不同的结果。Lanza 等[28]和 Loi 等[29]分别通过异种核移植获得了 3 头克隆野牛和 1 头克隆盘羊，在 3 头克隆野牛的11 种不同组织以及盘羊的血液中均只检测到受体卵母细胞来源的线粒体。我国科学家陈大元等在大熊猫与兔子的异种核移植研究中得到相反的结果。他们将大熊猫的体细胞移入去核兔卵母细胞中，采用大熊猫和兔线粒体 D-LOOP 区特异的引物扩增植入前囊胚和妊娠后胎儿中的 mtDNA，结果显示克隆囊胚中大熊猫及兔来源的线粒体共存，而着床后的胎儿中线粒体主要来源于供体大熊猫[30]。这可能由于早期的胚胎编码线粒体复制、转录、翻译的因子也同时表达；而随着胚胎发育，当核供体与核受体在遗传上亲缘关系较远，核基因编码的因子只能支持核供体来源的线粒体的发育。

不管造成克隆胚线粒体异质性的原因如何，已有的资料表明，克隆胚中线粒体的异质性可能是克隆效率低下，克隆胚胎流产率高，后代存活率低的重要原因之一。Lee 等[31]用绵羊成纤维细胞作为供核细胞，培养到第四代时，在细胞培养液中添加 50 ng/ml 的溴化乙锭去除 mtDNA，待供核细胞培养到第十代，mtDNA 的含量下降至初始含量的1.05%。以此细胞作为核移植的供核细胞获得的 SCNT 胚胎中只有受体卵母细胞 mtDNA，克隆后代存活率显著提高。这也很好地解释了为什么同体克隆效率明显高于异体克隆。

4 结语

细胞核移植技术具有重大的理论意义和实际价值，它不但是研究探索动物发育规律的一种重要技术手段，同时也已广泛应用到农牧和生物医药的各个领域。然而，体细胞核移植目前还存在不少问题，如核移植成功的总体效率仍较低、核移植的胚胎流产率仍然较高以及胚胎发育异常如“巨胎症”等问题。克隆胚胎的发育依赖于供体核和受体卵母细胞的相互作用，近年来的研究表明线粒体在体细胞核移植中发挥重要的作用，线粒体基因组的多态性，核基因组与线粒体基因组相容性以及重构胚中线粒体的异质性对克隆效率及克隆后代发育有重要影响。细胞核移植技术应用广泛，如在保护濒危物种、繁育优良畜种以及转基因动物制药等；另外，在医疗卫生领域，核移植技术使干细胞和组织工程在疾病治疗中的应用展现出广阔的前景。相信随着相关研究的不断深入，科学家们将进一步揭示核质互作的分子机制，有效地提高克隆的效率，让克隆技术更好地应用于医、药、农、研等多个领域。

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“儿童安全用药促进计划”项目启动

“儿童安全用药促进计划”由药品安全合作联盟（PSM）、北京药盾公益基金会共同主办，通过开展儿童安全用药关键技术研究，对临床医务工作者进行儿童安全用药相关技能培训，广泛开展儿童安全用药知识的宣传和普及活动，促进我国儿童用药安全，提升公众安全用药科学素质，为“药品安全”规划和“健康中国”战略服务。2016 年该项目纳入国家食品药品监督管理总局“全国安全用药月”活动。

2017 年，项目继续分为两个组（研究组和活动组）实施。研究组由北京儿童医院牵头，携同有关专家设立“中国儿童家庭用药科普干预研究”课题；活动组由 PSM 五个地区志愿者团队牵头走进 50 家幼儿园，开展“安全用药 娃娃抓起”科普宣传活动，活动以专家讲座的形式进行儿童安全用药科学知识普及。向幼儿家长发放《中国儿童家庭用药情况调研问卷》进行儿童用药情况调查。并向活动幼儿园赠送安全用药科普图书《妈咪药师谈儿童合理用药》，对幼儿园老师和家长进行用药指导，以增强安全用药意识。我会是 PSM 的副理事长单位，作为管理办公室负责项目的日常管理工作。

北京医学检验学会于2017年4月27日在北京成立

北京医学检验学会是由北京市民政局批准成立的具有非企业独立法人资格的学术团体，于 2017年 4 月 27 日在北京成立。学会的宗旨为“提高首都检验检测能力，搭建多学科交流平台”。该学会是由首都医科大学附属北京天坛医院、解放军总医院、北京协和医院、北京广安门医院、中国药品生物制品检定研究院、中国出入境检验检疫科学研究院等单位专家共同发起成立，由首都医科大学附属北京天坛医院检验科康熙雄教授任首届会长。

随着表观遗传学、基因工程与蛋白工程等新技术的发展，对检验医学提出了更高、更迫切的要求，学会初期拟下设八个分委会：医学实验室与诊断产品质量管理专业委员会；生物组学专业委员会；测试评价专业委员会；生物化学免疫专业委员会；微生物与感染专业委员会；体液和血液学检验专业委员会；体外诊断系统工程技术专业委员会；临床输血专业委员会。根据国内医学检验工作中存在的问题与实际需要将陆续成立相关的分委会，共同推动各专业领域的发展。

学会将以北京为中心，辐射京津冀开展学术交流；以学会为单位申报各类科研项目，协调开展多中心科学研究；加强科普宣传教育和义诊等公益活动，推动京津冀检验医学的学科发展。

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.011

中国工程院咨询研究项目（2016XY36）

200040 上海交通大学附属儿童医院/上海市儿童医院/上海交通大学医学遗传研究所/卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室/上海市胚胎与生殖工程重点实验室

曾溢滔，Email：ytzeng@stn.sh.cn

2017-04-11