Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中的免疫调节作用

赵小瑜 朱坚胜

Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中的免疫调节作用

赵小瑜 朱坚胜

慢性HBV感染者体内免疫细胞存在功能障碍，免疫功能无法发挥正常作用；其CD4+、CD8+T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞表面存在Tim-3、PD-1的过度表达。大量文献表明该现象与HBV持续感染、疾病的发生发展以及预后密切相关，推测Tim-3、PD-1或许可作为新的免疫靶点治疗慢性乙型肝炎。

HBV免疫调节Tim-3PD-1

慢性HBV感染在全世界范围内流行，据WHO报道全球约20亿人曾感染过HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者[1]；每年死于慢性HBV感染引起的并发症如肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌的人数高达65万[2]。慢性乙型肝炎（CHB）的病原体是HBV，它通过诱发被感染机体发生一系列免疫应答来影响病情发展，其中树突状细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞等免疫细胞所介导的免疫反应在慢性HBV感染中起着重要作用。有研究表明在CHB患者体内，以上免疫细胞存在不同程度的功能障碍，但引起该现象的机制尚未明确[3-6]。近年来，一些免疫分子在上述免疫细胞上的表达成为研究热点，其中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞上的T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）、程序性死亡受体-1（PD-1）的过度表达与慢性HBV感染密切相关，本文就以上2种免疫分子在慢性HBV感染过程中的免疫调节作用作一综述。

1 Tim-3

1.1 概述Tim-3是近几年慢性病毒感染以及肿瘤免疫研究的热点。Tim-3属于Tim家族，最早是McIntire等[7]在研究与哮喘相关的基因时发现，它是一段编码免疫球蛋白可变域和黏蛋白域的T细胞膜蛋白的基因。现已研究表明Tim基因共有8个，可编码4种蛋白，在鼠类为Tim-1、Tim-2、Tim-3和Tim-4，在人类为Tim-1、Tim-3和Tim-4[7]。所有Tim家族成员均为Ⅰ型细胞表面跨膜糖蛋白，包括信号序列、N端免疫球蛋白样结构域、黏蛋白结构域、跨膜区和包含酪氨酸磷酸化基的胞内区[8]。Tim-3与其配体半乳糖凝集素-9（Gal-9）所组成的信号通路在慢性病毒感染及肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。前期关于Tim-3在慢性病毒感染中免疫抑制作用的研究表明，如在HCV感染者外周血T淋巴细胞上的Tim-3表达高于健康者，当阻断Tim-3信号通路后，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的增殖和分泌功能也得到部分恢复[9]。此外，当HIV感染时，患者外周血NK细胞和T淋巴细胞上的Tim-3表达增加，经高效抗逆转录病毒治疗后，部分免疫应答患者Tim-3表达较治疗前有所下降[10]。而在肿瘤免疫中，Tim-3表达亦明显增强，甚至与疾病预后相关[11-13]。以上研究提示Tim-3的表达与慢性病毒感染及肿瘤发生、发展有关。

1.2 Tim-3与慢性HBV感染相关文献表明Tim-3在慢性HBV感染中发挥着免疫负调节作用。Rong等[14]研究发现在CHB患者外周血单个核细胞和NKT细胞表面的Tim-3表达较健康者明显升高，且在乙肝慢加急性肝衰竭患者中表现更为明显。Ying等[15]研究结果与其相似，此外课题组利用转染HBV的NK92细胞系以及HBV转基因小鼠模型，证实肝脏中NK细胞、CD8+T淋巴细胞上的Tim-3表达也明显上调；在此基础上进一步利用Tim-3抗体阻断Tim-3/Gal-9信号通路，发现NK细胞的细胞毒活性增强，且其分泌IFN-γ的量也相应增加。Wei等[16]研究结果显示，与健康者相比，CHB患者和急性乙型肝炎（AHB）患者外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞上的Tim-3表达均明显增强，且与疾病严重程度呈正相关；进一步随访发现经抗病毒治疗后，CHB患者的病情进入缓解期，AHB患者的病情进入恢复期时，其外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞上的Tim-3表达均明显下调。以上研究结果均提示Tim-3的过表达与CHB的发生、发展有关，且可能与疾病预后有关。此外，体外实验证实阻断Tim-3信号通路后，CHB患者外周血来源的CD8+T淋巴细胞在应对HBV抗原刺激时的增殖能力、分泌抗病毒细胞因子的能力均明显增强[17]；Nebbia等[18]研究结果亦证实了该结论。CHB是一种家族聚集性传染病，Liao等[19]研究发现Tim-3的基因多态性与HBV感染后的病情发展相关，他们猜测某个特定的单核苷酸多态性更有潜能进展为肝细胞癌或实现HBsAg血清学转化。

2 PD-1

2.1 概述PD-1是由2号染色体上Pdcd1基因编码、由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，作为受体表达于活化的T淋巴细胞上[20]。它最初是利用削减杂交方法在凋亡的小鼠T淋巴细胞杂交瘤中得到，是首个被发现用于识别淋巴细胞功能受损的表面标志物，属于B7/CD28超家族成员。PD-1目前已知有2个配体，即PD-L1和PD-L2。PD-L1也称B7-H1或CD274，是人类9号染色体Cd274基因编码、由290个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，表达于抗原提呈细胞和肿瘤细胞上，与PD-1结合主要起免疫抑制作用[21]。PD-L2也称B7-DC或CD273，能被诱导表达于树突状细胞、巨噬细胞上[22]，具有抑制T淋巴细胞活化的功能[23]。PD-1在慢性病毒感染中的免疫调节作用首次在小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染模型中发现，研究者发现在慢性感染小鼠体内衰竭的CD8+T淋巴细胞上存在着高表达的PD-1，而在清除病毒后的小鼠体内有记忆功能的CD8+T淋巴细胞上并不存在这种现象[24]；此外，在小鼠体内试验中阻断PD-1/PD-L1信号通路，会使病毒特异性CD8+T淋巴细胞数量增加、细胞功能强化，甚至会对病毒复制产生干扰[24]。在其他慢性病毒感染如HIV感染，Zhang等[25]研究发现病情进展组患者外周血CD8+T淋巴细胞上PD-1的表达高于病情无进展组，且细胞功能更弱；当阻断PD-1信号通路时，CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力得到部分恢复，且与HIV的易感性相关[26]。对于慢性HCV感染，有研究证实PD-1在T淋巴细胞上的表达量与其抗病毒疗效相关[27]。PD-1不仅在慢性病毒感染中发挥着重要作用，在肿瘤免疫中也具有重要调控作用。有研究报道可在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤组织中检测到PD-L1高表达，亦有体内外实验证实转染PD-L1的细胞表现出较弱的抗肿瘤侵袭能力[28]。近年来有一些研究机构开展的临床试验结果预示了抗PD-1药物在未来肿瘤免疫治疗中的潜在价值[29-30]。

2.2 PD-1与慢性HBV感染目前已有相关文献表明在HIV[25，31-32]、HCV[33-34]等慢性病毒感染中，PD-1信号通路在抑制病毒特异性CD8+T淋巴细胞的功能时具有重要的免疫调节作用。那么，PD-1在慢性HBV感染中的免疫调节作用如何？Peng等[35]研究发现CHB患者的HBV特异性CD8+T淋巴细胞上的PD-1表达明显高于AHB组和健康组，且与血清中的HBV-DNA病毒载量呈正相关。Germanidis等[36]将53例HBeAg阴性的CHB患者（包括30例处于病情活动期的患者和23例经长期抗病毒治疗后病情完全缓解者）纳入研究，结果表明在病情缓解状态下，肝组织上表达的叉头样转录因子P3、PD-1、PD-L1水平明显低于病情活动期，这提示PD-1可能与CHB预后有关。另有一项研究发现在慢性HBV感染的不同阶段（免疫耐受、免疫清除、病毒携带），外周血CD4+T淋巴细胞上的PD-1表达均高于健康者。此外有研究发现PD-1表达增加是由HBcAg通过JNK、ERK和PI3K/AKT信号通路诱导而发生[37]。Tzeng等[38]构建HBV感染模型小鼠进行研究，发现在HBV感染小鼠肝脏浸润性淋巴细胞上的PD-1表达增加，在小鼠体内阻断PD-1发现其HBV感染率下降。在体外实验中，Raziorrouh等[39]对CHB患者外周血来源的单个核细胞进行体外培养并阻断PD-1通路，发现上述来源的单个核细胞中CD4+T淋巴细胞的增殖能力再度活化，且其分泌Th1型细胞因子如IFN-γ、TNF-α也相应增加。虽然CHB患者外周血或组织细胞上的PD-1表达上调程度存在个体差异且与病情相关，但Ulger等[40]用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析表明与PD-1的基因多态性无关，这与Li等[41]研究结果不同，其具体机制尚需进一步探索。

3 Tim-3、PD-1与慢性HBV感染

由上可知，在包括HBV感染等慢性病毒感染过程中，Tim-3、PD-1各自起着负性调控免疫应答的作用。那么，同样作为免疫分子，这两者之间是否存在某种联系呢？Keir等[20]、Sharpe等[22]、Crawford等[42]曾提出阻断PD-1/PD-L1信号通路并不能完全恢复“衰竭”T淋巴细胞的功能，可见还存在其他调控分子对T淋巴细胞的功能起着负性调控作用。为了证实在慢性病毒感染过程中Tim-3与PD-1是否共表达在CD8+T淋巴细胞上，Jin等[43]研究了在急性和慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染时病毒特异性CD8+T淋巴细胞上的Tim-3、PD-1表达情况，发现慢性感染时Tim-3、PD-1表达均明显高于急性感染时；共表达Tim-3、PD-1的病毒特异性CD8+T淋巴细胞表现出更为严重的“功能衰竭”；在病毒感染小鼠体内同时阻断Tim-3和PD-1信号通路能明显改善CD8+T淋巴细胞的免疫应答并有效控制病毒，这种效应比单独阻断Tim-3或PD-1任一信号通路更为明显。Li等[41]利用PCR方法检测了845例慢性HBV感染者、141例感染过HBV且自行恢复者和318例健康者的Tim-3、PD-1基因多态性，发现这3组人群在PD1+8669 G/A、Tim3-1516 G/T两个位点的多态性存在差异，且与HBV导致的肝硬化、肝癌等密切相关，这提示在慢性HBV感染时，PD-1、Tim-3表达均增高。HBV导致的CHB、慢加急性肝衰竭患者中，其外周血CD8+T淋巴细胞上的Tim-3、PD-1表达均明显高于健康者，尤其是慢加急性肝衰竭患者的表达量更高[43]。Nebbia等[18]研究证实在慢性HBV感染过程中，在阻断PD-1通路的基础上再阻断Tim-3/Gal-9通路，对于HBV特异性T淋巴细胞免疫应答的增强可起到补充作用，提示了这2条通路对免疫抑制的相互协同作用。

4 总结

Tim-3、PD-1不仅在慢性病毒感染中具有免疫抑制作用，在肿瘤、自身免疫性疾病等其他慢性疾病中也具有重要的免疫调节作用。目前关于Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中免疫调节作用的研究越来越多，这2种免疫分子的过表达会影响免疫细胞的免疫活性，削弱其清除病毒的能力。建议学者积极探索慢性HBV感染过程中Tim-3、PD-1信号通路的靶点干预，研发新药物，为CHB临床治疗提供帮助。

[1]Ott J J,Stevens G A,Groeger J,et al．Global epidemiology of hepatitis B virus infection:new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity[J]．Vaccine,2012,30(12):2212-2219．

[2]Rafael L,Mohsen N I,Kyle F,et al．Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 [J]．Lancet,2012,380(9859):2095-2128．

[3]Sun H H,Zhou D F,Zhou J Y．The role of DCs in the immunopathogenesis of chronic HBV infection and the methods of inducing DCs maturation[J]．J Med Virol,2016,88(1):13-20．

[4]Park J J,Wong D K,Wahed A S,et al．Hepatitis B virus-specific and global T-cell dysfunction in chronic hepatitis B[J]．Gastroenterology,2016,150(3):684-695．

[5]Zhang J,Feng G,Zhao Y,et al．Association between lymphocyte-tomonocyte ratio(LMR)and the mortality of HBV-related liver cirrhosis:a retrospective cohort study[J]．BMJ Open,2015,5 (8):e008033．

[6]Rehermann B．Natural killer cells in viral hepatitis[J]．Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2015,1(6):578-588．

[7]McIntire J J,Umetsu S E,Akbari O,et al．Identification of Tapr(an airway hyperreactivity regulatory locus)and the linked Tim gene family[J]．Nat Immunol,2001,2(12):1109-1116．

[8]Meyers J H,Sabatos C A,Chakravarti S,et al．The TIM gene family regulates autoimmune and allergic diseases[J]．Trends Mol Med,2005,11(8):362-369．

[9]Golden-Mason L,Palmer B E,Kassam N,et al．Negative immune regulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis C virus infection and its blockade rescues dysfunctional CD4+and CD8+T cells[J]．Journal of Virology,2009,83(18):9122-9130．

[10]De Kivit S,Lempsink L J,Plants J,et al．Modulation of TIM-3 expression on NK and T cell subsets in HIV immunological non-responders[J]．Clin Immunol,2015,156(1):28-35．

[11]Cheng G,Li M,Wu J,et al．Expression of Tim-3 in gastric cancer tissue and its relationship with prognosis[J]．Int J Clin Pathol, 2015,8(8):9452-9457．

[12]Wiener Z,Kohalmi B,Pocza P,et al．TIM-3 is expressed in melanoma cells and is upregulated in TGF-beta stimulated mast cells[J]．J Invest Dermatol,2007,127(4):906-914．

[13]Cai C,Zhang J,Li M,et al．Interleukin 10-expressing B cells inhibit tumor-infiltrating T cell function and correlate with T cell Tim-3 expression in renal cell carcinoma[J]．Tumour Biol,2016, 37(6):8209-8218．

[14]Rong Y H,Wan Z H,Song H,et al．Tim-3 expression on peripheral monocytes and CD3+CD16/CD56+natural killer-like T cells in patients with chronic hepatitis B[J]．Tissue Antigens,2014,83 (2):76-81．

[15]Ying J,Nan H,Jing M,et al．T cell immunoglobulin and mucindomain-containing molecule-3(Tim-3)mediates natural killer cell suppression in chronic hepatitis B[J]．J Hepatol,2010,52 (3):322-329．

[16]Wei W,Yu S,Jie L,et al．Tim-3 expression on peripheral T cell subsets correlates with disease progression in hepatitis B infection[J]．Virol J,2011,8:113．

[17]Wu W,Shi Y,Li S,et al．Blockade of Tim-3 signaling restores the virus-specific CD8(+)T-cell response in patients with chronic hepatitis B[J]．Eur J Immunol,2012,42(5):1180-1191．

[18]Nebbia G,Peppa D,Schurich A,et al．Upregulation of the Tim-3/galectin-9 pathway of T cell exhaustion in chronic hepatitis B virus infection[J]．PLoS One,2012,7(10):e47648．

[19]Liao J,Zhang Q,Liao Y,et al．Association of T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule 3(Tim-3)polymorphisms with susceptibility and disease progression of HBV infection[J]．Plos One,2014,9(5):e98280．

[20]Keir M E,Butte M J,Freeman G J,et al．PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J]．Annu Rev Immunol,2008,26:677-704．

[21]Sharpe A H,Freeman G J．The B7-CD28 superfamily[J]．Nat Rev Immunol,2002,2(2):116-126．

[22]Sharpe A H,Wherry E J,Ahmed R,et al．The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection[J]．Nat Immunol,2007,8(3):239-245．

[23]Latchman Y,Wood C R,Chernova T,et al．PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation[J]．Nat Immunol, 2001,2(3):261-268

[24]Blackburn S D,Crawford A,Shin H,et al．Tissue-specific differences in PD-1 and PD-L1 expression during chronic viral infection:implications for CD8 T-cell exhaustion[J]．J Virol,2010, 84(4):2078-2089．

[25]Zhang J Y,Zhang Z,Wang X,et al．PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+T cells exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors[J]．Blood,2007,109(11):4671-4678．

[26]Paris R M,Petrovas C,Ferrando-Martinez S,et al．Selective loss of early differentiated,highly functional PD-1 high CD4+T cells with HIV progression[J]．PLoS One,2015,10(12):e0144767．

[27]Salem M L,El-Badawy A．Programmed death-1/programmed death-L1 signaling pathway and its blockade in hepatitis C virus immunotherapy[J]．World J Hepatol,2015,7(23):2449-2458．

[28]Dong H,Strome S E,Salomao D R,et al．Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J]．Nat Med,2002,8(8):793-800．

[29]Zitvogel L,Kroemer G．Targeting PD-1/PD-L1 interactions for cancer immunotherapy[J]．Oncoimmunology,2012,1(8):1223-1225．

[30]Curran M A,Montalvo W,Yagita H,et al．PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(9):4275-4280．

[31]Day C L,Kaufmann D E,Kiepiela P,et al．PD-1 Expression on HIV-Specific T Cells Is Associated With T-Cell Exhaustion and Disease Progression[J]．Nature,2006,443(7109):350-354．

[32]Petrovas C,Casazza J P,Brenchley J M,et al．PD-1 is a regulator of virus-specific CD8+T cell survival in HIV infection[J]．J Exp Med,2006,203(10):2281-2292．

[33]Golden-Mason L,Palmer B,Klarquist J,et al．Upregulation of PD-1 expression on circulating and intrahepatic hepatitis C virus-specific CD8+T cells associated with reversible immune dysfunction[J]．Journal of Virology,2007,81(17):9249-9258．

[34]Urbani S,Amadei B,Tola D,et al．PD-1 expression in acute hepatitis C virus(HCV)infection is associated with HCV-specific CD8 exhaustion[J]．J Virol,2006,80(22):11398-11403．

[35]Peng G,Li S,Wu W,et al．PD-1 upregulation is associated with HBV-specific T cell dysfunction in chronic hepatitis B patients [J]．Mol Immunol,2008,45(4):963-970．

[36]Germanidis G,Argentou N,Hytiroglou P,et al．Liver FOXP3 and PD-1/PDL-1 expression is down-regulated in chronic HBV hepatitis on maintained remission related to the degree of inflammation[J]．Front Immunol,2013,4:207．

[37]Li M,Sun X H,Zhu X J,et al．HBcAg induces PD-1 upregulation on CD4+T cells through activation of JNK,ERK and PI3K/AKT pathways in chronic hepatitis-B-infected patients[J]．Lab Invest,2012,92(2):295-304．

[38]Tzeng H T,Tsai H F,Liao H J,et al．PD-1 blockage reverses immune dysfunction and hepatitis B viral persistence in a mouse animal model[J]．PLoS One,2012,7(6):e39179．

[39]Raziorrouh B,Heeg M,Kurktschiev P,et al．Inhibitory phenotype of HBV-specific CD4+T-cells is characterized by high PD-1 expressionbutabsentcoregulationofmultipleinhibitory molecules[J]．PLoS One,2014,9(8):e105703．

[40]Ulger Y,Bayram S,Sandikci M U,et al．Relationship between programmed cell death-1 polymorphisms and clearance of hepatitis B virus[J]．Int J Immunogenet,2015,42(3):133-139．

[41]Li Z,Li N,Zhu Q,et al．Genetic variations of PD1 and TIM3 are differentially and interactively associated with the development of cirrhosis and HCC in patients with chronic HBV infection[J]．Infect Genet Evol,2013,14:240-246．

[42]Crawford A,Wherry E J．The diversity of costimulatory and inhibitory receptor pathways and the regulation of antiviral T cell responses[J]．Curr Opin Immunol,2009,21(2):179-186．

[43]Jin H T,Anderson A C,Tan W G,et al．Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection[J]．Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(33):14733-14738．

2016-07-25）

（本文编辑：陈丹）

浙江省医药卫生科技计划项目（2012KYB237）

317000温州医科大学附属台州医院感染科

朱坚胜，E-mail：zhujs@enzemed.com