TaqMan-MGB法检测ACTN3基因 R577X多态性

张志明,高鹏华,胡辽辽，马 莹*

(1.西安市中心医院 检验科，陕西 西安710003；2.西北大学 体育部，陕西 西安710069；3.西安交通大学第一附属医院 检验科，陕西 西安710061)

TaqMan-MGB法检测ACTN3基因 R577X多态性

张志明1,高鹏华2,胡辽辽3，马 莹1*

(1.西安市中心医院 检验科，陕西 西安710003；2.西北大学 体育部，陕西 西安710069；3.西安交通大学第一附属医院 检验科，陕西 西安710061)

目的 研制检测ACTN3 基因R577X多态性的TaqMan-MGB探针方法。方法 根据美国国立医学图书馆网站公布的人类ACTN3基因序列(rs1815739)，设计检测ACTN3基因R577X多态性的特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化实验条件。 结果 对98例西北大学汉族学生进行ACTN3 基因R577X多态性检测,并对上述所有检测标本再进行碱基序列测序，两种检测方法的检测结果经 Kappa分析，Kappa=0.99。 结论 两种检测方法结果一致性较好，建立了检测ACTN3基因 R577X多态性的TaqMan-MGB法。

实时荧光定量；ACTN3；基因多态性

(ChinJLabDiagn,2017,21:0831)

人类ACTN3基因位于11号染色体，由于其外显子1747位碱基存在C-T碱基多态性，使得原编码的第577位精氨酸(CGA)密码子变成了终止密码子(TGA)而编码任何蛋白,于是导致了ACTN3蛋白的缺失，其原基本功能可由其家族中其它蛋白来补偿，因而也不会发生肌肉疾病，即为ACTN3 基因R577X多态性(或C1747T多态性，rs1815739)[1,2]。近年来ACTN3基因 R577X多态性是否与运动员素质(速度、爆发力以及耐力)之间存在关联性已成为近年来众多国内外运动医学研究者的研究热点[3,4]，于是如何建立快速、准确的ACTN3基因 R577X多态性的检测方法就成为研究者们首要的课题，实时荧光定量TaqMan-MGB是检测基因多态性的一种成熟可靠的方法，本研究的目的就是通过建立和优化ACTN3基因 R577X实时荧光定量TaqMan-MGB检测体系，为ACTN3基因 R577X多态性研究提供可靠的技术保障。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器设备：DYY-2C型电泳仪(北京六一仪器厂)、美国应用生物系统公司(ABI)生产的ABI 7300 PCR扩增仪及ABI3130 型DNA测序仪。主要试剂:琼脂糖(BBI公司)、PCR Premix试剂、Loading Buffer(宝生物工程大连有限公司)、DNA提取液(中山大学达安基因股份有限公司)、美国应用生物系统公司TaqMan Universal PCR Master Mix(货号：4304437)。

1.2 基因组总DNA提取

采集检测者外周静脉血3 ml于无任何添加剂的普通干燥管中，3 000 r/min离心10 min，分离血清,采用煮沸法提取人类基因组总DNA，200 μl DNA提取液中加入200 μl血清充分振荡混匀，100℃金属浴中煮沸10 min后，12 000 r/min 离心10 min取其上清液，-20℃冷冻保存。

1.3 TaqMan-MGB法检测ACTN3基因 R577X

1.3.1 PCR 引物设计与合成

针对ACTN3基因 R577X多态性位点(Genebank：rs1815739)，设计并不断甄别上下游特异引物，上游引物为5′-GCGCTAGAGCGGAGGAGAAG-3′，下游引物为5′-GCGGCCCTGCTCCACCAATC -3′，R 等位基因探针:FAM-GAGGCTGACTGAGAG,X等位基因探针:VIC-GAGGCTGACCGAGAG，上述检测探针和引物均有上海生物工程有限公司合成。

1.3.2 基因多态性检测及分型结果判定

使用美国应用生物系统ABI 7300实时荧光定量PCR仪进行多态性检测，PCR反应体系如下：研究对象模板DNA 5 μl,TaqMan通用反应试剂30 μl，上、下游引物及检测探针各0.5 μl，最后用双蒸水补足总反应体积为50 μl，反应条件分别为先94℃ 变性8分钟后 92℃ 20秒和55℃50秒共40个循环，荧光检测期为55℃50秒，如果检测结果为单一FAM黑色报告曲线即为RR基因型或为单一VIC绿色报告曲线则为XX型，如果黑色和绿色两个曲线均出现则为杂合子RX。

1.4 基因序列测序进行ACTN3基因 R577X

[5]设计上下游引物序列分别为:上游引物5′-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3′下游引物5′-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3′。扩增后片段包括577位密码子目标基因，产物长度为290 bp，反应总体积为50 μl：模板DNA4 μl，上下游引物各0.5 μl，PCR反应通用体系45 μl,反应条件：预变性95℃ 2 min，变性 95℃ 40 s，退火55℃ 30 s，延伸 72℃ 40 s共40个循环后，最后72 ℃ 延伸5 min，扩增产物再经电泳提纯后送上海生物工程有限公司在全自动ABI3130 型DNA测序仪上进行产物测序检测。

1.5 TaqMan-MGB法和基因序列测序一致性评价

使用SPSS 13.0统计软件Kappa分析进行评价。

2 结果

2.1 TaqMan-MGB法检测ACTN3基因 R577X结果

共检测98例西北大学汉族学生，平均年龄为21±3.9岁，其中男43例，女55例。检测结果为RR基因型32例，占(32.65%，32/98),RX基因型48例，占(48.98%，48/98),RR基因型18例，占(18.37%，18/98)。

2.2 基因序列测序进行ACTN3基因 R577X结果

上述98例检测标本重新经测序引物扩增、电泳提纯后外送测序，除1例测序失败外，其他97例均测序成功并与TaqMan-MGB法检测ACTN3基因 R577X结果吻合。

2.3 Kappa分析

TaqMan-MGB法与基因序列测序检测结果经 Kappa分析，Kappa=0.99，表明这两种检测方法结果一致性较好。

3 讨论

存在于人类骨骼肌中的α-辅肌动蛋白(α-actinin)是肌动蛋白的结合蛋白，其家族中有辅肌动蛋白-1、2、3和4共 4种存在形式，与运动员杰出能力表现有关的主要为ACTN 3基因，尤其该基因577位点的多态性[6]，从2003年澳大利亚学者Yang等[7]发现ACTN3基因 R577X多态性与杰出运动员的能力表现有一定的关联性后，国内外学者对该基因位点的多态性与杰出运动员的能力表现进行了许多关联性研究，以色列学者Ben-Zaken等[8]对137例跑步运动员和91例游泳运动员以及217例对照组研究表明，在无论长跑还是短跑运动员与对照组间基因型比较均有统计学意义(P<0.05),并且短距离游泳运动员与短跑运动员比较RR基因型和R等位基因显著增高，日本学者Kikuchi等[9]对1057例日本田径运动员，其中627例为力量型运动员，430例为耐力型运动员，对照组810例进行了大样本队列研究，研究结果也证实了杰出运动员的能力表现与ACTN3基因 R577X多态性有关，为此ACTN3基因R577X多态性作为杰出运动员能力的预测和基因选材越来越受到体育科研人员的关注。

目前，随着分子运动医学的发展，研究基因多态性的方法也较多，但各许多方法由于其自身方法学特点存在着各自的优缺点，比如目前多数研究常采用的PCR-限制性片段长度多态性、等位基因特异性-PCR,由于均需先PCR扩增后，扩增产物再经琼脂糖凝胶电泳后才能区分基因型，虽然此类方法操作简单，实验成本较低，一般实验室容易开展，但其灵敏度低，整个实验耗时，比较容易受其他标本污染，容易造成假阳性及假阴性。基因碱基序列测序是目前最为准确、可靠的基因多态性分型方法，但它需DNA 测序仪等昂贵仪器，并且对测序标本有一定的严格要求，本研究中一例标本测序失败可能与前期标本处理有关，TaqMan-MGB法则利用MGB探针标记不同基因型的探针，整个实验过程在实时荧光定量PCR仪中完成，无需电泳等后处理，利用TaqMan方法学特点大大提高了其方法学的特异度和灵敏度。

为了评价TaqMan-MGB法和基因序列测序两种检测方法的一致性，本研究中98例标本均经两者方法独立检测，进行ACTN3基因 R577X分型，检测结果经 Kappa分析，Kappa=0.99，一般认为Kappa 值越大，则两种方法的一致性就越好，如果Kappa 值≥0.75,说明两种方法一致性较好；如果Kappa 值<0.40，则表明两种方法一致性不够理想。

综上所述，本研究建立的检测ACTN3基因 R577X多态性的TaqMan-MGB法适用于杰出运动员能力的预测以及运动候选基因选材的研究。

参考文献：

[1]陈伟民，娄婧婧，赵广才.爆发力相关基因ACTN3_C1747T多态性快速检测方法研究[J].中国运动医学杂志,2014,33(3):229.

[2]杨晓琳,胡 扬,李燕春,等.ACTN3基因C1747T多态位点作为举重运动员选材用分子标记的可行性研究[J].体育科学,2010,30(1):70.

[3]何恩鹏,刘晓明,王国英.新疆维吾尔族运动员ACTN3基因R577X多态性研究[J].中国应用生理学杂志,2014,30(2):140.

[4]Mikami E,Fuku N,Murakami H,et al.ACTN3 R577X Genotype is Associated with Sprinting in Elite Japanese Athletes[J].Int J Sports Med,2014,35(2):172.

[5]高鹏华，张志明.ACTN3基因多态性与运动能力和基因选材的研究[J].西北大学学报(自然科学版)，2015,45(4):602.

[6]杨若愚,王予彬,沈勋章,等.基因多态性与杰出运动能力[J].中国组织工程研究,2014,18(7):1121.

[7]Yang N,MacArthur DG,Gulbin JP,et al.ACTN3 genotype is associated with human elite athletic performance[J].Am J Hum Genet,2003,73(3):627.

[8]Ben-Zaken,Alon Eliakim,Dan Nem，et al.ACTN3 Polymorphism:Comparison Between Elite Swimmers and Runners[J].Sports Med Open，2015,1(1):13.

[9]Kikuchi Naoki,Miyamoto-Mikami Eri,Murakami Haruka,et al.ACTN3 R577X genotype and athletic performance in a large cohort of Japanese athletes[J].European Journal of Sport Science,2015，23(3):1.

Detection of R577X polymorphism of ACTN3 gene by TaqMan-MGB

ZHANGZhi-ming1,GAOPeng-hua2,HULiao-liao3,etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China;2.DepartmentofPhysicalEducation,NorthwesternUniversity;3.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity)

Objective To develop a TaqMan-MGB probe method for the detection of R577X gene polymorphism in ACTN3 gene.Methods Designed to detect the ACTN3 R577X polymorphism of specific primers and TaqMan MGB probe,according to the National Library of Medicine published on the website of human ACTN3 gene sequence rs1815739,to establish and optimize the experimental conditions.Results 98 cases of Northwestern University Students of Han nationality of ACTN3 R577X polymorphism detection,and in all the specimens and sequence,two methods of detection results by kappa analysis,Kappa=0.99.Conclusion The results of the two methods are in good agreement,and the TaqMan-MGB method for the detection of R577X gene polymorphism in ACTN3 gene was established.

real time fluorescence quantitative;ACTN3;gene polymorphism

陕西省体育局常规课题(15019)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0831-03

R392

A

张志明(1976-)，男，硕士，副主任检验师，研究方向：临床检验诊断学。

2016-04-15)