自噬与凋亡在肠道病毒感染细胞过程中的影响及其相互作用

李纯 温红玲

250012 济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室

·综述·

自噬与凋亡在肠道病毒感染细胞过程中的影响及其相互作用

李纯 温红玲

250012 济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室

肠道病毒感染可引起一些严重的疾病，如脊髓灰质炎病毒感染导致急性弛缓性麻痹、柯萨奇病毒感染导致病毒性心肌炎和无菌性脑膜炎等、埃可病毒感染引起发热和无菌性脑膜炎等、肠道病毒71型感染导致心肺功能障碍和神经系统疾病等。近年来越来越多的研究发现，细胞自噬与凋亡在肠道病毒感染过程中有重要作用。本文就自噬和凋亡在肠道病毒感染过程中的影响及二者的相互作用进行综述。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81371833);Key Research and Development Projects of Shandong Province(2015GSF118162)

肠道病毒(Enterovirus, EV)属于小RNA病毒科，基因组为单股正链RNA，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus, CVB)、埃可病毒(Echovirus)和新型肠道病毒。多数EV感染表现为轻症，且具有自限性，部分感染累及中枢神经系统，导致严重的并发症，包括急性弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎等，严重者导致患儿死亡，其致病机制尚未完全阐明，近年来越来越多的研究发现，细胞自噬与凋亡在病毒感染与免疫过程中有重要作用，为阐述肠道病毒的致病机制提供了新视角。

1 细胞自噬

细胞自噬是一种将细胞质中受损的细胞器或者大分子物质递送至溶酶体中降解的过程，可分为自噬囊泡的形成，自噬体的形成，自噬体与溶酶体形成自噬溶酶体，自噬溶酶体的降解这四个步骤。在这个过程中，自噬基因Beclin-1和其他自噬相关基因Atg发挥了关键作用。细胞自噬是机体清除入侵病原体的重要机制，在病原体感染与免疫方面发挥重要作用。然而，近年来越来越多的研究表明，有些病原体在与宿主长期的相互作用过程中进化出逃逸、抑制或策反自噬途径的机制，促进自身复制或传播，自噬在感染和免疫中表现出多重功能。微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)蛋白和自噬性底物标志物p62蛋白能较好地反映自噬水平。

2 细胞凋亡

细胞凋亡是发生在多细胞生物体内受基因调控的细胞主动死亡过程，对正常组织发育和内环境的稳定起重要作用。根据启动阶段的不同,细胞凋亡通路分为内源性凋亡信号通路和外源性凋亡信号通路。半胱天冬蛋白酶caspase在细胞凋亡中起着至关重要的作用，无论是内源性还是外源性凋亡信号通路，最终都通过激活caspase来完成凋亡。有研究表明，肠道病毒可以通过调节细胞凋亡以利于自身的生存，如脊髓灰质炎病毒通过抑制凋亡以实现自身复制最大化[1]，而肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)通过促进细胞凋亡以释放病毒颗粒[2]。

3 细胞自噬和凋亡的相互作用

细胞的自噬性死亡和凋亡最终都是引起细胞死亡，但它们却是两条不同的死亡通路。自噬是细胞为了维持自身生存的主动过程，适度自噬有利于细胞存活。而凋亡是受机体调控的主动死亡过程，正常的凋亡有利于维持内环境的稳定。自噬和凋亡之间的关系非常密切，二者可以通过某种分子机制互相调控。参与自噬体形成的紫外抗性相关基因( UVRAG)通过与 Bax结合，抑制其从胞浆转移至线粒体，从而发挥抗凋亡[3]。在凋亡对自噬的调控研究中，caspase介导的自噬基因Beclin-1裂解能抑制细胞自噬，同时促进细胞凋亡，因Beclin-1裂解后会抑制自噬发生，但裂解后的Beclin-1片段转运至线粒体，与Bax共同促进细胞色素C从线粒体释放，导致细胞凋亡[4]。

4 肠道病毒感染与细胞自噬和凋亡之间的关系

4.1 柯萨奇病毒 研究发现，CVB3感染细胞后，检测到LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例升高，表明自噬体的生成增多，随后使用自噬抑制剂巴弗洛霉素(作用是抑制自噬溶酶体的形成)发现，LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达均增强，说明自噬体生成增加，而自噬体的降解功能正常，这进一步说明了CVB3在感染细胞的过程中自噬体增加的原因在于自噬体生成增多[5]。Shi等[6]通过3-MA和siRNA干扰Atg5表达，结果表明抑制自噬体的形成能抑制CVB3的复制，而当抑肽素、E64 d、亮抑肽酶(溶酶体酶抑制剂)和氯喹(溶酶体降解阶段抑制剂)作用于CVB3感染的细胞时，对CVB3的复制能力没有影响，这些抑制实验说明了自噬体数量增加能促进病毒复制，因此自噬体可能对于CVB的复制起着关键调节作用。目前对于CVB感染细胞诱导自噬的机制尚不清楚，有研究表明CVB3和CVB4能以一种钙蛋白酶依赖方式来诱导自噬，从而促进病毒的复制[7]。Wu等[8]发现非结构蛋白2B具有促进细胞自噬的能力，而且2B单独表达后检测到2B与LC3-Ⅱ共定位于自噬体中，经过进一步的研究发现2B蛋白的跨膜疏水区是诱导自噬的特定氨基酸残基的关键位点。

CVB3病毒感染细胞后对凋亡的调节具有两面性作用，一方面通过2A切割死亡相关蛋白5上调p53蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达以诱导凋亡[9]，另一方面通过CVB 3C蛋白调节宿主细胞分子机制以抑制凋亡[10]。

自噬和凋亡参与调节CVB的复制和释放，有研究指出，在CVB3感染HeLa细胞的过程中，使用自噬诱导剂雷帕霉素诱导自噬体的形成，细胞内CVB3病毒mRNA水平及上清液中病毒滴度升高，而用自噬抑制剂3-MA抑制自噬体的形成后，细胞内CVB3病毒mRNA水平及上清液中病毒滴度降低，说明细胞自噬能促进CVB3复制和释放，另一方面，使用凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡能使LC3-Ⅱ的数量增加以及beclin-1、Atg5的裂解片段减少，细胞培养上清液中的病毒滴度降低，说明抑制凋亡会促进细胞自噬，同时抑制病毒释放[11]。

钙蛋白酶参与调节细胞自噬和凋亡，CVB3 感染细胞后能激活钙蛋白酶， 从而增强自噬作用，进而促进病毒复制， 此外自噬和凋亡之间也存在一定的相互作用来影响病毒毒力，表现为钙蛋白酶的激活所导致的自噬增强明显抑制了casepase-3的活性和细胞凋亡，从而促进病毒的复制[7]。自噬有利于CVB在细胞中的增殖，而凋亡有利于病毒从细胞中释放。自噬和凋亡之间的相互作用影响着CVB在感染细胞中的复制周期。

4.2 肠道病毒71型 EV71病毒可以诱导RD-A细胞和SK-N-SH细胞发生自噬，从而促进病毒复制，且自噬的发生在一定范围内随着染毒时间的延长而增加，通过不同类型的自噬抑制剂证明了自噬抑制剂在一定浓度范围内可以抑制细胞的自噬作用，此外，自噬的发生可以促进细胞内VP1水平的升高和细胞上清液病毒滴度的增加，因而说明了EV71诱导的自噬有利于病毒的复制[2，12]。

体内实验表明， EV71 感染 ICR 小鼠能引发自噬流，同时检测发现 EV71感染小鼠的脑组织中的 VP1蛋白的水平和病毒滴度升高， 说明自噬能促进病毒的复制。 此外， 对感染 EV71 的小鼠使用 3-MA 处理组小鼠出现疾病症状的时间比对照组晚， 且在早期阶段疾病症状较轻，但存活率与对照组无差异 EV71 在其他类型细胞如 U251 上也能通过激活Bax 和 caspase-9 诱导凋亡的发生，说明抑制自噬可推迟小鼠症状的出现并能在早期减轻症状，但由于小鼠的存活率并未升高，且有研究表明3-MA在饥饿和正常的生理条件下能抑制和促进自噬[13]，因此需要进一步优化实验条件以增加3-MA对自噬的抑制作用，同时需要使用自噬基因敲除小鼠来获得自噬参与EV71发病机制的确切证据[14]。

对于EV71感染细胞后凋亡机制的研究发现，EV71在SH-SY5Y细胞中通过刺激凋亡相关基因表达，引起促凋亡蛋白Bax，caspase-7和caspase-3的表达水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，从而诱导细胞凋亡[15]。此外， EV71 在其他类型细胞如 U251 上也能通过激活Bax 和 caspase-9 诱导凋亡的发生[16]。目前有研究表明，EV71的非结构蛋白2A, 2B, 3C参与凋亡的调节，其中2B蛋白通过Bax诱导细胞凋亡，3C蛋白通过切割端粒结合蛋白PinX1促进细胞凋亡，从而促进病毒释放[17-19]，2A，2B，3C虽然具有诱导凋亡的能力，但目前对于这些非结构蛋白在自噬流中作用的研究较少，因此细胞自噬和凋亡之间的相互调控关系也需要进一步的研究。

渥曼青霉素、抑肽素、E64 d和氯喹均为自噬抑制剂，可通过作用于自噬的不同阶段抑制自噬，同时各自通过不同的机制抑制或促进细胞凋亡。渥曼青霉素通过抑制LC3型别转换抑制自噬体形成，另一方面，渥曼青霉素通过增强UVRAG和Bax的表达抑制凋亡蛋白酶活化及细胞色素c的释放抑制凋亡；抑肽素和E64 d通过抑制溶酶体酶的活性抑制自噬，同时还能抑制caspase-3的活化从而抑制细胞凋亡；氯喹通过调节细胞pH抑制溶酶体降解，此外，氯喹通过增强caspase-3的活化及PARP的裂解，从而促进EV71感染诱导的细胞凋亡[2，12]。这种现象说明自噬抑制剂作用于自噬不同阶段对EV71诱导细胞凋亡有不同的影响。

凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK能促进EV71感染细胞内LC3-Ⅱ型蛋白水平升高和p62水平降低，说明抑制凋亡促进了自噬体的生成和自噬流的发生。通过对感染EV71的细胞使用凋亡诱导剂硼替佐米，发现促进细胞凋亡能抑制自噬[12]。

对EV71感染的细胞使用自噬抑制剂渥曼青霉素和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK作用后，观察病毒滴度发现，细胞培养上清液中病毒颗粒的数量会随着渥曼青霉素和Z-VAD-FMK浓度的增加而逐渐减少。利用siRNA干扰Atg5和caspase-3的表达后，病毒滴度会降低，这些实验说明了抑制自噬体形成或凋亡会减少EV71病毒颗粒的释放[2]。

EV71感染细胞过程中，自噬体的形成和细胞凋亡之间呈负反馈调节，抑制自噬体形成能促进凋亡，从而增加病毒颗粒的释放，反之则减少病毒颗粒的释放，而自噬体与溶酶体融合阶段及效应阶段可能伴随诱导凋亡促进病毒的释放[3]。

4.3 脊髓灰质炎病毒 脊髓灰质炎病毒已经被证实影响自噬途径，在用脊髓灰质炎病毒感染细胞后，可检测到LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例升高，另外用siRNA干扰LC3和Atg12的表达后，病毒产量降低[20]，而用自噬诱导剂雷帕霉素或它莫昔芬作用于感染脊髓灰质炎病毒的H1-HeLa细胞时，病毒产量增加[21]。而对于脊髓灰质炎病毒诱导自噬的分子机制研究发现，脊髓灰质炎病毒的非结构蛋白2BC和3A共同表达能诱导自噬体形成，进而促进病毒的释放[22]，此外，通过将非结构蛋白2BC和3A在人胚胎肾(HEK)293T细胞中共同表达，能检测到溶酶体相关膜蛋白LAMP1(晚期内体和溶酶体标志物)和LC3共定位，而当单独表达时，未观察到这种共定位[23]，这些结果证实，脊髓灰质炎病毒在感染细胞中能诱导自噬，同时通过抑制自噬体的成熟增加病毒的复制。值得注意的是，自噬体的形成需要2BC和3A共同作用，2BC单独表达只能诱导单层膜囊泡的形成，因此对于3A在自噬体形成的过程中的具体作用及其他蛋白诱导和调节自噬的作用还需进一步研究。

脊髓灰质炎病毒同样能诱导细胞发生凋亡，从而影响病毒的释放。其机制是脊髓灰质炎病毒感染细胞能促进细胞质中Ca2+浓度升高，随后Ca2+通过受体通道从内质网释放进入线粒体并在线粒体中积累，最终导致线粒体功能障碍和细胞凋亡[24]。

4.4 埃可病毒 E-7以内吞方式进入细胞，这一过程可能受到自噬相关基因调节。用siRNA沉默自噬相关基因如Beclin-1, Atg12, Atg14, Atg16或LC3，结果表明E-7感染细胞的能力下降，另外，自噬抑制剂3-MA对E-7的感染有明显的抑制作用，因3-MA抑制PI3K的活性，说明PI3K活性对于E-7的进入过程有重要作用，这些结果表明自噬相关蛋白可能参与病毒进入宿主细胞的过程，但实验同时观察到使用3-MA抑制自噬后细胞内依然聚集着病毒颗粒，因此，对于PI3K与病毒进入细胞的方式之间的关系还需要进一步研究[25]。

5 总结

一般认为，自噬和凋亡在肠道病毒感染过程中的作用具有两面性，一方面自噬和凋亡有利于清除侵入细胞的病毒，维持细胞的生存，另一方面自噬和凋亡能为病毒所用，促进病毒的复制和释放，这两方面的作用是如何以一种量效关系存在的还需研究，而且目前对于肠道病毒感染中自噬和凋亡发生的机制尚不清楚，深入研究自噬和凋亡对肠道病毒感染的作用，有利于为肠道病毒致病机制的研究提供新思路，同时有利于通过调节自噬和凋亡调控肠道病毒颗粒的产生和释放，为寻找新的抗病毒药物提供一定的线索。

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(本文编辑：唐浏英)

Effects of autophagy and apoptosis on Enterovirus infected cells and their interactions

Li Chun, Wen Hongling

Department of Virology, School of Public Health, Shandong University,Jinan 250012,China

Wen Hongling, Email:wenhongling@sdu.edu.cn

Enterovirus infection can cause severe disease in human,such as poliovirus can lead to acute flaccid paralysis, coxsackievirus infection can lead to viral myocarditis and aseptic meningitis.Enterovirus 71 infection can lead to cardiopulmonary dysfunction and neurological diseases.In recent years, more and more studies have found that cell autophagy and apoptosis play an important role in the process of enterovirus infection.In this paper,the interactions of autophagy and apoptosis in the process of enterovirus infection are reviewed.

Enterovirus；Autophagy；Apoptosis

温红玲，Email:wenhongling@sdu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.020

肠道病毒属；自噬；细胞凋亡

国家自然科学基金(81371833)；山东省重点研发计划项目(2015GSF118162)

2017-03-01)