CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展

黄佳杞 黄秦特 章国卫

●综 述

CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展

黄佳杞 黄秦特 章国卫

常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白9（clustered reg ularly intersp aced short p alind romic rep eats，CRISPR）/（CRISPR-associated p roteins 9，Cas 9）改造的第3代人工核酸内切酶，因其简单、高效等优点，已成为一种热门的基因编辑工具。近年来一些研究成功应用CRISPR/Cas 9系统在体内外进行相关疾病基因的靶向修饰，为基因编辑技术在临床的应用奠定了基础，但其脱靶效应、导入方式、编辑效率等仍需改进。本文将对CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用进展作一综述。

CRISPR/Cas9 基因治疗 应用研究

精确的基因编辑可以通过敲除内源性的致病基因或插入新的保护基因以永久性地改变基因而起到治疗疾病的作用。常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/（CRISPR-associated proteins 9，Cas 9）作为第3代基因组编辑工具，与第1代锌指核糖核酸酶（ZFN）和第2代转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）相比，CRISPR/Cas 9具有更易于操作、编辑效率更高、更容易得到纯合子突变体且可以在不同的位点同时引入多个突变等显著优势。因此，CRISPR/ Cas 9得到了广泛的关注和应用。目前CRISPR/Cas 9在基因治疗中的应用研究主要集中于单基因遗传病、病毒感染和肿瘤等疾病。本文对CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展综述如下。

1 CRISPR/Cas9工作原理

CRISPR/Cas系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒。CRISPR/Cas系统可分为3种类型，其中类型ⅡCRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。类型ⅡCRISPR/Cas系统只需要Cas9蛋白、crRNA（CRISPR RNA）、tracrRNA（transactivating crRNA）、RNaseⅢ4种成分即可发挥作用。CRISPR能够转录产生前体crRNA（pre-crRNA）,与此同时tracrRNA也转录出来，tracrRNA结合pre-crRNA并且激发Cas9和双链RNA特异性RNaseⅢ核酸酶对pre-crRNA进行加工，产生成熟的crRNA，crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对，而其3′端能够与tracr－RNA及Cas9蛋白形成复合物，从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性地切割[1]。通过人工设计crRNA与tracrRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA），Cas9内切酶在sgRNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制（HDR）或者非同源末端连接机制（NHEJ）对断裂的DNA进行修复[2]。不仅如此，Cas9还要识别靶基因区长2～5个碱基的PAM序列，这个短的 DNA序列通常在靶DNA的3′末端发现，在Cas9的识别和切割中发挥重要作用，同时也作为自我识别系统防止sgRNA本身被当作靶位点[3]。

2 CRISPR/Cas9系统在单基因遗传病基因治疗中的应用

对单基因遗传病的治疗是基因治疗研究中最主要的研究领域。目前，CRISPR/Cas9技术在杜氏肌营养不良综合征（duchenne muscular dystrophy，DMD）、囊性纤维化、地中海贫血、血友病和酪氨酸血症等疾病的治疗研究中获得了显著的进展。

2.1 DMD DMD是一种X染色体隐性遗传疾病，主要由编码抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）的基因突变所致，抗肌萎缩蛋白是一个细胞骨架蛋白，负责在骨骼肌细胞的肌动蛋白和细胞外基质之间建立连接。抗肌萎缩蛋白的缺失使肌肉细胞易受损伤，导致患者肌肉退化与病变。近年来已有多项研究将CRISPR/Cas9技术应用于DMD的治疗。德克萨斯大学西南医学中心Olson实验室使用CRISPR/Cas9成功矫正了DMD小鼠模型中的抗肌萎缩蛋白基因。他们以受精卵显微注射的方式将针对突变基因的sgRNA、Cas9 mRNA和提供同源修复片段的单链寡核苷酸DNA共注入DMD小鼠受精卵中，在新生的嵌合体小鼠中抗肌萎缩蛋白基因的矫正率可达到2%～100%，小鼠的肌肉生理功能得到显著改善[4]。在另一项研究中，杜克大学Gersbach实验室针对抗肌萎缩蛋白基因的突变热点第45～55外显子设计单个或多个sgRNA，利用Cas9引进碱基插入或缺失，成功地矫正了突变位点的蛋白阅读框，纠正了DMD患者成肌细胞中的DMD基因突变，基因编辑后的成肌细胞可以在体外及体内条件下表达正常的抗肌萎缩蛋白[5]。在此基础上，哈佛大学、杜克大学和德克萨斯大学3家科研机构的研究团队同时成功地应用CRISPR/Cas9对DMD小鼠进行了体内基因编辑。他们均以腺相关病毒为载体运载CRISPR/Cas9部件进入小鼠体内，在治疗后小鼠中观察到了小鼠肌肉细胞膜上重新出现抗肌萎缩蛋白，证实了治疗后小鼠肌肉力量的增加，并且证实在全身治疗中，包括心肌在内的全身各肌肉均见到抗肌萎缩蛋白重新表达[6-8]。腺相关病毒已成功地应用于人体临床试验中，是基因治疗中最成熟的病毒载体。以上在DMD小鼠模型体内进行基因编辑研究为进一步将该技术应用于人体治疗奠定了基础，可以预期该项技术将很快有望进入临床试验阶段。

2.2 囊性纤维化 囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传性疾病，其突变基因是CFTR基因，其中90%的基因突变集中于该基因第11外显子的F508缺失。荷兰皇家科学院Hubrecht研究所的Schwank等[9]针对CFTR基因的F508缺失突变分别设计了靶向第11外显子和11内含子的sgRNA，将这两个sgRNA各自和编码野生型CFTR序列的同源重组供体DNA共转染患者肠干细胞，可成功地矫正F508缺失。对含有矫正后CFTR基因的细胞进行筛选扩增，证明了这些细胞恢复了野生型细胞的功能。这项研究表明了对囊性纤维化患者干细胞进行靶向编辑的可行性，但是由于囊性纤维化涉及身体多处器官，因此要实现对患者的治疗还需进一步发展对多脏器基因治疗的方法。

2.3 β地中海贫血 β地中海贫血是一种最常见的单基因遗传病，是因血红蛋白β-球蛋白（HBB）基因突变导致的一类贫血症。目前唯一的治愈方法是进行造血干细胞移植，然而组织相容造血干细胞的缺乏使许多患者难以获得有效治疗。患者来源的诱导多功能干细胞（iPSCs）分化产生的造血干细胞可为移植提供可靠的细胞资源，若能将患者来源的iPSCs进行突变基因矫正，然后分化成为造血干细胞则可回输至患者体内发挥治疗作用。不同的研究小组成功尝试了这种治疗途径。美国简悦威实验室将β地中海贫血患者来源的成纤维细胞诱导分化成iPSCs，然后针对HBB基因突变位点设计了CRISPR/Cas9载体和同源重组DNA模板，两者共转染患者iPSCs，经筛选获得了HBB基因修复后的iPSCs。结果显示，经基因修正后的细胞核型正常，在向造血细胞分化的过程中，可以高比例的生成各类造血祖细胞，并恢复β-球蛋白的表达[10]。国内高绍荣实验室也成功地获得了β地中海贫血患者来源的iPSCs，并以CRISPR/ Cas9修正了细胞中的突变[11]。

2.4 血友病 血友病是一种遗传性出血性疾病，是因缺乏凝血因子导致的凝血障碍性疾病，主要分为A和B两型，分别由缺乏凝血因子Ⅷ和Ⅸ导致。临床上对血友病的治疗主要使用替代疗法，即通过输注重组合成或从血浆中提取纯化的凝血因子以恢复患者血浆中的凝血因子水平达到治疗效果[12]。替代疗法可以有效地治疗和防止急性出血，可是仍然不能防止关节损伤的发生，除非在儿童期即开始预防性治疗。但是由于预防性治疗的高昂费用，绝大多数血友病患者仍没有接受规范治疗。基因治疗是有可能彻底治愈该疾病的唯一方法，CRISPR/Cas9技术也被应用于血友病的基因治疗中。Park等[13]通过CRISPR/Cas9技术对血友病A患者体细胞来源的iPSCs中的凝血因子Ⅷ基因进行修正，经过修正的iPSCs分化成为可以表达凝血因子Ⅷ的成熟内皮细胞，移植到血友病A小鼠体内后，小鼠开始产生凝血因子Ⅷ，有效地抑制了出血症状。Guan等[14]分别通过注射裸露DNA和腺病毒载体的方式，利用CRISPR/Cas9系统修正了血友病B小鼠肝脏细胞中F9基因的一个点突变，部分恢复了小鼠的凝血功能，证明了可直接通过对肝细胞的基因修复达到治疗目的。但其基因修复效率仍然过低，且凝血功能的改善还需进一步提高。最近，Wilson实验室采用腺相关病毒双载体系统成功地将金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）、sgRNA和F9基因cDNA导入血友病B小鼠肝脏中，矫正了突变的小鼠F9基因并成功表达凝血因子Ⅸ，恢复了小鼠凝血功能[15]。

2.5 Ⅰ型酪氨酸血症 Ⅰ型酪氨酸血症是由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶的失活致使酪氨酸代谢障碍而导致的遗传性疾病。最近Yin等[16]成功地在Ⅰ型酪氨酸血症小鼠模型上实现了以CRISPR/Cas9技术进行该疾病的基因治疗。他们以脂质纳米颗粒包裹运载Cas9 mRNA，以腺相关病毒运载sgRNA和修复DNA，在6%肝脏细胞中实现了突变基因的原位矫正，治疗小鼠体重得到显著改善。这项研究以脂质纳米颗粒直接包裹Cas9 mRNA达到了Cas9在肝细胞中高效表达的目的，同时避免了由于Cas9基因过大而难以在腺相关病毒中包装的问题。这种脂质纳米颗粒和腺相关病毒联合介导CRISPR/Cas9的基因组编辑功能是靶向肝细胞基因治疗的一种有效手段。

2.6 重症联合免疫缺陷（SCID） Janus家族激酶JAK3基因突变可导致SCID，JAK3的缺陷可表现为T细胞和NK细胞的缺失，B细胞数量正常但功能低下。Chang等[17]通过SCID患者来源的iPSC和T细胞体外分化系统证实，在JAK3缺失情况下，早期T细胞的发育受到阻碍。随后，他们通过CRISPR/Cas9矫正了JAK3突变，并以矫正后的iPSC分化产生了具备生理功能的NK细胞和T细胞。该项研究为SCID的基因治疗提出了新的方法，可为SCID的治疗提供更安全的基因治疗策略。

3 CRISPR/Cas9系统在病毒感染类疾病治疗中的应用

CRISPR/Cas9作为一种新的基因组编辑技术也为诸多病毒感染疾病的治疗提供了新的手段。利用CRISPR/Cas9的靶向切割特性设计病毒DNA特异的sgRNA以引导该核酸酶直接靶向清除细胞内的病毒是一条极具吸引力的治疗路线。目前已有多项研究在实验室中证明了CRISPR/Cas9对病毒感染治疗的可能性。

3.1 人乳头瘤病毒（HPV） HPV是宫颈癌的高风险诱发因子，Kennedy等[18]针对HPV中的两个癌基因E6和E7设计了靶向sgRNA和CRISPR/Cas9系统，可有效作用于宫颈癌细胞中的HPV并杀死癌细胞。此外，相同的策略也可成功靶向切割Burkitt淋巴瘤细胞中的EB病毒基因组和细胞株中的人多瘤病毒，均达到了抑制病毒复制的效果[19-20]。

3.2 艾滋病病毒（HIV） HIV通过逆转录成为双链DNA后整合到宿主细胞基因组中以原病毒形式长期潜伏，难以清除。通过设计针对HIV-1序列特异的sgRNA使CRISPR/Cas9直接靶向作用于HIV-1病毒序列，可直接清除插入细胞基因组中的HIV-1原病毒[21-23]，并可同时清除存在于细胞质中的HIV-1病毒DNA[23]，更使细胞形成对HIV-1的免疫[22]。CCR5蛋白是人免疫缺陷病毒（HIV）入侵淋巴细胞的关键辅助受体，CCR5基因发生32bp的删除（CCR5△32），可使细胞形成对HIV-1感染的抗性。Ye等[24]用CRISPR/Cas9技术对正常人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行了CCR5△32突变，结果显示，33%的细胞发生了CCR5双等位基因的定向突变，在将突变后的hiPSCs诱导分化为单核/巨噬细胞后，这些细胞显示出对HIV感染的抗性。此外，将病毒激活蛋白与失去核酸酶活性的Cas9形成融合蛋白能够靶向识别的并且激活存在于细胞内的HIV-1原病毒，结合高效抗逆转录病毒疗法（HAART）或可最终实现对HIV-1的彻底清除[25]。

3.3 乙型肝炎病毒（HBV） HBV在宿主细胞中可形成共价闭合环状DNA，这给抗病毒治疗带来困难，但可成为CRISPR/Cas9的理想作用靶点。有研究组通过小鼠尾静脉注射HBV表达载体质粒构建慢性HBV感染小鼠，然后将靶向HBV基因组的Cas9-sgRNA质粒共注射到小鼠尾静脉，检测发现小鼠血清表面抗原水平较对照组明显降低[26]。有研究者设计了靶向HBV表面抗原DNA区域的Cas9/gRNA系统，在体外实验和HBV转基因小鼠模型中都证明了可以有效地造成靶向位点的突变，抑制病毒基因的复制与表达[21]。这些研究初步探索了CRISPR/Cas9对HBV治疗的方法并证明了其可行性。

4 CRISPR/Cas9系统在肿瘤基因治疗中的应用

CRISPR/Cas9首先在肿瘤模型的建立中得到了成功应用。肿瘤模型的建立是研究肿瘤发生、发展的机制和探索治疗方法的前提。肿瘤通常伴随多基因突变，传统的方式很难构建多基因共同突变的疾病模型，CRISPR/Cas9可用来进行体内的多基因突变肿瘤模型的构建，从而更好地模拟复杂的人类疾病。如在一项对肺腺癌的研究中，Platt等[27]采用CRISPR-Cas9系统实现了Kras、p53、Lkb1基因在小鼠体内的共同突变，最终使小鼠体内出现肺腺癌的病理变化。此外，Heckl等[28]构建了一个同时表达Cas9蛋白和多种sgRNA的慢病毒表达载体，成功地将多达5种sgRNA和Cas9共同递送入单个小鼠造血干细胞中，同时对5个靶基因进行编辑，导致细胞的克隆化与恶性改变。运用此技术，研究中成功地在小鼠中制备出了多基因突变的急性粒细胞白血病模型。更多的研究进一步证明了CRISPR/Cas9系统可用于制备多种肿瘤模型[29]。

不难预期如果以CRISPR/Cas9靶向修饰细胞内肿瘤相关基因则可能起到治疗肿瘤的作用，体外研究也证明了CRISPR/Cas9可有效抑制肿瘤细胞的生长[30]。但在体内情况下，由于CRISPR/Cas9基因转移的效率仍然很低，很难实现对大量肿瘤细胞的有效靶向清除，因此这种策略的临床应用可行性不高。目前情况下以CRISPR/Cas9结合肿瘤免疫治疗是一种较为可行的肿瘤基因方法。肿瘤免疫治疗在最近获得了巨大的突破，通过基因工程改造的T细胞拥有了靶向肿瘤细胞的杀伤能力，展现出了令人振奋的治疗效果。以靶向CD19的嵌合抗原受体基因改造的T细胞成功地使30例急性淋巴细胞白血病患者中的27例得到了完全缓解[31]。通过基因组编辑技术对T细胞进行精确的基因改造将可进一步提高嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）的治疗效果和安全性，而CRISPR/Cas9表现出了对T细胞更高效的基因修饰功能，有可能对T细胞进行多重基因改造以满足临床治疗的复杂需要[32]。

程序性死亡分子1（PD1）是存在于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面的膜蛋白，PD1有两个配体，PDL1和PDL2。许多肿瘤细胞表面可表达PDL1和PDL2，PDL1和PDL2与PD1的结合可抑制T细胞对肿瘤细胞的免疫作用，使肿瘤细胞逃避免疫系统的清除。阻断PD1与其配体的作用可恢复T细胞对肿瘤细胞的免疫作用，这一点在PD1抗体的应用中已得到证实[33-34]。而采用CRISPR/Cas9靶向敲除T细胞中的PD1基因后，可恢复T细胞对黑色素瘤细胞株的杀伤作用，表明这可能是一种肿瘤基因治疗的有效方式，为CRISPR/Cas9靶向基因改造T细胞进行肿瘤治疗提供了新的途径[35]。

5 CRISPR/Cas9系统在其他疾病基因治疗中的应用

CRISPR/Cas9技术的建立也为其他疾病的治疗提供了新的思路。例如研究发现PCSK9（proproteinconvertasesubtilisin/kexin type 9）基因编码的PCSK9蛋白被肝细胞分泌到血浆中，作为低密度脂蛋白受体（LDLR）拮抗物，它可以限制低密度脂蛋白的摄取，从而增加血浆中LDL-C的水平。PCSK9的失活或功能抑制可使血中LDL-C水平下降，降低心血管疾病风险。因此PCSK9成了新型降胆固醇药物研发的重要靶点。Ding等[36]用腺病毒载体将靶向PCSK9的sgRNA和CRISPR/ Cas9导入小鼠肝脏细胞中，成功地实现了对PCSK9的靶向编辑，编辑效率可达50%以上。PCSK9表达水平显著下降，LDL-C水平降低35%～40%。该项技术为临床高胆固醇血症的治疗提供了新的基因治疗方法，该方法有望实现对疾病的长期预防和治疗效果[36]。此外，CRISPR/Cas9也展现出了对耳聋及眼部疾病基因治疗的应用价值[37-39]。

6 CRISPR/Cas9系统的临床应用前景和展望

CRISPR/Cas9技术自问世以来，以其强大的基因编辑功能和易于操作的优点迅速成为了分子生物学研究的前沿领域，极大地促进了生物医学研究的发展。同时，也在最短的时间内走出实验室迈向临床。四川大学华西医院肿瘤学家卢铀领导的团队成为了最先开展CRISPR/Cas9临床试验的科学家，他们将开展一项针对非小细胞肺癌的临床治疗研究[40]。该治疗方案通过提取患者外周血的T淋巴细胞，在体外以CRISPR/Cas9对其中的程序性死亡基因PD-1进行敲除，然后将细胞回输患者体内以恢复其抗肿瘤能力。该团队已于2016年10月对第1例患者实施了治疗。来自北京大学的研究团队也将采用相同的策略开展对膀胱癌、前列腺癌和肾细胞癌的临床试验。在未来，成熟的CRISPR/Cas9基因编辑技术将为精准医疗和个体化医疗服务，应用前景广阔。但CRISPR/Cas9技术若要完全进入临床治疗仍然需要解决一些重要问题，如仍需提高Cas9编辑基因的效率、建立Cas9基因安全高效的导入方式、增强编辑的基因特异性和避免脱靶效应等，最终实现安全地将这项颠覆性的技术真正服务于患者。

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2017-01-09）

（本文编辑：马雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.17.2017-70

国家自然科学基金面上项目（81170531）；浙江省自然科学基金一般项目（LY17H080004）

310036杭州师范大学医学院

章国卫，E-mail：gzhang@hznu.edu.cn