糖尿病细胞治疗的研究进展

刘英 江霞

·综述·

糖尿病细胞治疗的研究进展

刘英 江霞

糖尿病细胞治疗能重建胰岛β细胞功能，为治愈糖尿病提供了可能。胰岛移植是一种能够稳定控制血糖并且耐受良好的治疗手段，可有效改善血糖代谢及并发症的发生发展，提高生活质量，但稀缺的胰腺供体和长期免疫排斥治疗引发了多能干细胞的相关性研究，目前已在糖尿病小鼠的基础试验中证实了其具有逆转糖尿病的潜能，然而安全是其致命的弱点。近些年，针对胰腺祖细胞的体外研究显示通过化学方法可以刺激腺泡或α细胞转化为β细胞新生并在不需要移植的情况下改善胰腺功能，规避不良反应。所以，糖尿病细胞治疗是潜能与风险并存的，只有扬长避短，才能为糖尿病治疗提供新的有效的方法。

糖尿病； 胰腺； 移植； 多能干细胞； 细胞转分化

糖尿病是日益严重的世界公共卫生问题，截止到2011年全球的糖尿病患者已经达到3.66亿人，预计到2030年糖尿病患者将激增至4.39亿人[1-2]。大量循证医学研究显示，糖尿病患者重建胰岛内源性分泌系统对延缓糖尿病并发症的发生及发展至关重要，所以寻求更有效的治疗方法成为内分泌临床医生亟待解决的问题。近些年，越来越多的学者将细胞治疗作为糖尿病的治疗靶点。本文将从胰岛移植、多能干细胞分化及体细胞的重组或转分化等方面来阐述糖尿病细胞治疗的研究进展。

一、胰岛移植

（一）人胰岛移植

20世纪70年代，胰岛分离和纯化技术的出现使胰岛移植从基础研究进展到临床阶段，并使1型糖尿病的细胞治疗成为现实。2012年胰岛移植登记处（collaborative islet transplant，CIT）的数据显示，677例接收胰岛移植（单独或联合肾移植）的患者，3年后（2007年至2010年）有44﹪的患者脱离胰岛素治疗，60﹪的患者维持糖化血红蛋白低于6.5﹪，只有48﹪的患者需要胰岛细胞再移植治疗[3]。在针对此研究的回顾性分析总结出对临床结果起决定性作用的是胰岛细胞分离纯化技术、体外灌注技术及免疫抑制方案的改善，而不是输注的胰岛当量（islet equivalent quantity，IEQs）的变化。

胰岛移植的必要条件是极其复杂的，免疫抑制方案的不断优化，显著改善了胰岛移植的预后。大量研究表明[4-7]，胰岛移植物更易遭受CD8+T细胞介导的排斥反应，活化的CD8+T细胞可通过多种途径杀伤胰岛移植物。靶向杀伤免疫细胞是一种新的抗胰岛排斥反应治疗策略，主张在不干扰正常免疫功能的情况下实现抗胰岛移植排斥反应。在CIT-07研究中对48例1型糖尿病患者给予胰岛移植的同时（3次输注，中位数11 476 IEQ/kg），联合西罗莫司，兔抗胸腺细胞球蛋白，依那西普和他克莫司+西罗莫司的维持治疗[8]，患者在行移植术2年后仍具有80﹪的移植物功能，并改善了血糖水平及生活质量。Inverardi等[9]将粒细胞集落刺激因子和艾塞那肽与经典免疫抑制药物（他克莫司，西罗莫司，依那西普，赛尼哌）相结合来治疗移植后的免疫反应，此法可使70﹪的患者移植物功能延长至4 500 d。

移植物的长期存活，还决定于术中胰岛细胞团所引起的急性凝血反应及术后局部血供。最近的研究集中在对胰岛移植原位血管的改进。2015年，Pepper等[10]在小鼠皮下植入一个尼龙导管，以促进新生血管网形成，并将其作为移植胰岛的环境。也有研究尝试使用血管内皮生长因子提高移植部位胰岛血管化[11-12]。微囊化是由Boettler和他的同事提出的一个免疫隔离装置，既实现免疫隔离，同时又允许胰岛素和葡萄糖分子通过。但由于半透膜技术的不完善，使胰岛出现相对缺氧状态及血运重建缓慢，在功能上难以实现平稳的血糖控制[13]。

目前胰岛移植仍面临许多困境：尸体供体短缺，往往需要两三个胰腺才能获得移植时充足的IEQs供应（2×106β细胞/kg）和移植后血糖控制，终身免疫抑制治疗和胰岛移植物的存活依赖于门静脉提供高效的能量与氧气交换技术的瓶颈。所以目前胰岛组织的冷冻保存也是一个值得关注的问题，最新的数据显示[14]通过冷冻保存20年后，人类胰岛细胞能保持原有的纯度，钙离子水平和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）与新鲜分离的胰岛相比降低了胰岛素含量，从而在小鼠模型中对逆转糖尿病能力存在负面影响。

（二）猪胰岛移植

猪作为细胞治疗的重要来源具有许多优点：供应量大，胰岛制剂纯度高以及该技术已在非人类灵长类动物中得到证实[15-16]。2016年ADA年会，David教授[17]提出使用转基因动物既减少了人畜共患病，又可以克服免疫抑制疗法和微囊化技术的缺陷，这也是人类通过对供体塑造改善移植预后的首次尝试。动物研究曾证实猪胰岛移植联合抗免疫抑制治疗的可行性，实验将链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）处理的恒河猴给予成年猪胰岛移植并联合眼镜蛇毒因子、抗胸腺细胞球蛋白、抗CD154单克隆抗体及低剂量西罗莫司治疗后，血糖维持正常水平可达6个月以上，且无严重不良影响。

猪胰岛细胞移植到人体内长期存活的实例已被数次证实：1996年1例41岁的T1DM患者移植了猪胰岛细胞后，能有效改善血糖水平，且10年后利用腹腔镜技术在其网膜上观察到存活并有功能的猪胰岛细胞[18]。2007年，在俄罗斯进行的1项研究针对8例T1DM患者给予微囊化猪胰岛移植（DIABECELL，5 000～10 000 IEQ/kg/剂量，共3次）的观察，6例患者改善了血糖、糖化血红蛋白水平，并减少了胰岛素用量，2例患者脱离胰岛素治疗长达32周，且没有严重的不良事件发生（包括猪内源性逆转录病毒感染）。在新西兰（NCT00940173），16例糖尿病自身抗体阳性的T1DM患者接受不同量的胰岛细胞移植（从5 000～20 000 IEQ/kg），观察52周后，患者无意识低血糖发作的数量减少、糖化血红蛋白下降且日均胰岛素需要量也减少。移植耐受性好且患者自觉生活质量得到了改善。另一个类似的研究开展于阿根廷（NCT01739829），从研究中也能观察到移植后患者糖化血红蛋白水平降低（从8.6﹪到6.7﹪），胰岛素需要量减少（减低了20﹪的日剂量）并且减少了无意识的低血糖发生次数（减少了70﹪）。虽然只有少数患者可以停用胰岛素，但证明了微囊化移植猪胰岛细胞装置在人体中使用的安全性和有效性。

二、多能干细胞

（一）胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）

多能干细胞能重新编程以获得β细胞样功能，其有利于细胞替代方法的优势在于：表型特征的建立，应用广泛，高扩增和分化潜能。21世纪初，第一次证实ESCs具有变为GSIS物质的能力，在特定的培养条件和分子方法下可实现分化。Kroon等[19]和D'amour等[20]逐步在体外试验中发现将干细胞植入糖耐量正常的SCID小鼠后能转化为β样细胞，给予STZ处理移植后小鼠，血糖水平能保持在正常范围反映了ESCs来源的β样细胞的GSIS接近移植人胰岛的水平。然而，体内实验[21]发现ESCs有形成畸胎瘤的倾向，它的机制可能为移植未分化的ESCs导致扩增细胞亚群染色体异常促进癌症发生[22]。到现在为止，选择ESCs进行改善内分泌激素或β样细胞的移植可行性尚不确定，问题在于极低数量的多能干细胞可能导致肿瘤形成以及大量β细胞选择和纯化技术的不成熟。考虑到这些问题，ViaCyte公司开发了胶囊系统，在此胰腺祖细胞来源的ESCs能在皮下移植后成熟为有功能的β样细胞，现在这项技术已应用于临床，试验结果尚待公布。

ESCs大量分化为β样细胞谱系的技术也在逐步改善中。2012年，Rezania等[23]概括了内分泌标志物的功能，通过一个四步法技术，获得人类ESCs，其中包括98﹪PDX1+ 细胞，50﹪胰腺内胚层细胞（NKX6.1+ / PDX1+），12﹪胰岛素+细胞，19﹪胰高血糖素+细胞和70﹪H1细胞。给予糖尿病小鼠移植3个月后，移植物能在移植后4～5个月维持血糖水平正常。然而，50﹪的大鼠出现畸胎瘤（骨和软骨），充分表明低比例的PDX1−细胞影响了机体的无序生长和分化。所以，同一研究组又进一步改进了四步法分化技术，以限制人ESCs来源的内分泌细胞移植后的致瘤问题[24]。对技术的修改（单细胞播种H1细胞，在1～2阶段添加培养液，增加蛋白激酶活性剂的浓度，和第4阶段降低ALK5抑制剂浓度）没有提高更多的分化率（如培养14 d后90﹪PDX1+，50﹪NKX6.1+和20﹪内分泌细胞），但在移植21周后减少了非内胚层组织的比例（下降到1/74）。在体外，新技术方法使第4阶段非胰腺细胞基因的表达（例如：OCT4，aFP）及β细胞标记物（包括胰岛素、NKX2.2、NEUROD1、CHGA）降低了，并且使糖尿病小鼠移植后3个月内移植物功能正常，改善血糖水平及C肽分泌。Rezania等[25]和Pagliuca等[26]两个团队也分别进行了体外研究，应用不同的程序方法对人多能干细胞移植后葡萄糖敏感GSIS水平与人自身β细胞的功能进行比较，但目前这些β样细胞能否逆转高血糖，以及对移植物长期的组织学影响情况还不清楚。

尽管相关研究表明ESCs移植后可逆转糖尿病，但仍有几个应用难点，如伦理上胚胎细胞的采样和细胞重新编码的缺陷，如不同的ESCs细胞再生分化的差异性，不适当的肝细胞样功能，在体内不能再生复制的问题。人ESCs来源的β样细胞免疫隔离技术已成功在同源免疫缺陷动物模型上使用，但长期分化表达的情况还不确定。诱导多能干细胞可以依据编码需求同化为ESCs，但其生产成本和对其积累表观遗传的关注或编码异常仍是其使用的关注方向[27-28]。大型动物研究（例如，非人类灵长类动物）和正在进行的临床试验将进一步明确上述问题并确认小鼠模型中累积的数据。

（二）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs起源于中胚层，是成体干细胞的一种，具有以下特征：（1）取材方便简单，人体取材时对健康无损害；（2）易于分离和体外传代培养，扩增潜力强并具有很高的基因稳定性；（3）移植后免疫反应低，无成瘤性；（4）无伦理学争议。因此，MSCs被认为是可用于临床细胞学治疗的理想种子细胞。母义明等将骨髓来源MSCs注射进T2DM鼠体内，通过免疫印迹法测定出在其骨骼肌、肝脏、脂肪组织内，磷酸化的胰岛素受体底物-1及蛋白激酶B明显上升，其血糖也得到控制，提示 MSCs 能在外周组织中减轻胰岛素抵抗[29]。MSCs还可通过使用诱导试剂（如烟酰胺、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等）或与胰腺组织共培养皆能成功将MSCs诱导为胰岛素分泌细胞。而且MSCs能释放一些免疫调节相关因子，如IFN-γ、转化生长因子-β、IL-4、IL-10等，减轻因自身免疫性破坏而导致的β细胞减少，从而保护新生及残余的β细胞[30]。在由STZ诱导的T1DM 动物实验中，MSCs能分化成GSIS细胞，并以血糖依赖性释放胰岛素的方式控制高血糖及改善糖尿病症状[31]。

虽然MSCs在糖尿病及糖尿病并发症治疗方面得到了越来越多的证实，且大量学者致力于其改善临床症状的机制研究，但其诱导分化条件以及定向诱导分化的调控机制还不是很清楚。目前亟待解决的重要问题包括：寻找更好的纯化方法和简便准确的鉴定方法，在增殖的同时保持其多向分化潜能，促进目的细胞的组织特异性整合和功能发挥，进一步提高MSCs在损伤部位的存活及修复等等。

三、胰腺内的体细胞

目前，关于胰腺内是否有存活干细胞还不太清楚，但胰腺本身确实具有损伤后的外分泌功能再生以及部分细胞成分具有可塑性或β细胞转分化的能力[32]。

（一）β细胞

β细胞复制是目前最直接的方法用以恢复胰岛素产生细胞的质量，现有相关研究也集中在这个方面，希望能寻找到有效的体内治疗方法[33]。上皮β细胞缺乏在体外有丝分裂的活性，但可以通过表型转变来实现扩展。Efrat团队在不同但却特定的条件下生产出的高增殖β细胞衍生物可逆转STZ处理的NOD-SCID小鼠的高糖毒性[34]。

人类胰岛也被叫做胰源性祖细胞（pancreatic-derived multipotent precursors，PMPs），它可在体外分离并于克隆的条件下进行转分化。这些PMPs移植后能产生足够的胰岛素来稳定STZ诱导的糖尿病NOD-SCID小鼠的血糖水平[35]，效果类似于人类胰岛。此外，PMPs的 glut2low表型能让他们在STZ处理后的小鼠和人类胰岛中扩增，且“激活”的PMPs能增强β细胞分化潜力[36]。这些前期研究对大规模生产PMPs是至关重要的，但仍需要在移植模型中进一步证实这些前体细胞的潜力。

（二）α细胞

α-β细胞的转分化也是目前关注的焦点。Collombat等[37]对STZ处理的转基因小鼠给予胰高血糖素表达的α细胞后能改善β细胞功能。Thorel 等[38]通过白喉毒素损伤几乎99﹪的β细胞后引发α细胞的大量产生以及α-β细胞的重组，这与Collombat的研究结果[37]相一致。但在严重的胰岛细胞损失的模型中却没有发现α细胞的这种自发倾向[39]。Collombat团队还对ArxKO糖尿病小鼠持续α细胞补充来观察血糖恢复情况，通过抑制Arx来代替过表达Pax4，这项基于GABA或GABA受体激动剂的模型方法，开辟了新的治疗途径。但目前关于向β细胞转化的机制是否有年龄依赖性以及其是否依赖部分其他亚型（如：δ细胞）[40]的争论仍然存在。

虽然α-β细胞的重组在体外被得到证实，但体内α-β细胞的转分化和α-β细胞的新生仍是值得进一步探究的。

（三）腺泡细胞

Zhou等[41]人研究发现腺泡细胞作为胰腺的主要细胞在关键转录因子Ngn3，Pdx1和MafA的过表达情况下能形成新的β细胞。腺病毒介导的重组足以使腺泡细胞向功能性胰岛素产生的细胞转化，且能够在一周内完全恢复STZ诱导的Rag1-/-糖尿病小鼠模型的高血糖。且同组研究人员还使用一个多顺反子携带三个转录因子来提高腺泡细胞重组的效率[42]，并能长期维持血糖正常。

为避免腺病毒结构和多转录因子的使用，Heimberg团队研发了一个对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠通过腹膜渗透泵输注细胞因子（表皮生长因子与神经营养因子）的系统[43]，该系统输注后65﹪的动物胰岛素水平升高，而此举对STZ处理的小鼠反应欠佳。谱系追踪显示在细胞因子诱导后，腺泡细胞起源的新形成的β细胞能在扩增前转变为Ngn3+表型并于5 d后使血糖标准化。这对于改善β细胞功能来说是一个重大的突破，但需更多研究来明确“脱靶”表皮生长因子的影响，特别是与肿瘤的相关性。

腺泡细胞被认为是可被操控的能转化为β细胞的胰腺祖细胞，而人类腺泡细胞体外扩增仍然是繁琐的且有自发表型的转变[44]。

（四）导管细胞

导管细胞是胚胎胰腺内分泌和外分泌的祖细胞[45-46]，但他们在出生后作为兼性干细胞对β细胞再生的作用尚具争议[47]。谱系追踪通过对HNF1β+和SOX9+细胞的观察推断导管细胞对改善β细胞质量无明显作用[48]。然而既往的研究中发现导管细胞能产生新的α细胞。基因诱导的缺陷型α细胞能转变为β细胞，此过程犹如促发了导管细胞向α细胞转化的开关。

此外，导管细胞在纯化，培养和运输等方面具有较强的优势。一些研究证实了通过特定的膜蛋白对导管细胞进行分类的可能性[49]和其向β细胞分化的潜能，但是在体外导管细胞缺乏持续性增殖和易迅速失去表型的特性[50]。基于此，Lysy等[51]研究通过对人类CA19-9+导管细胞部分上皮间质转化，使其大规模扩增22倍，并于1个月后收集培养了1 011细胞[52]，这些人导管源性细胞暴露于特定生长因子及小分子环境下，14 d内即具有特异性的β细胞特征（包括GSIS）。此外，人导管源性细胞能抑制克隆的扩增和干细胞标记的表达，解决了移植后无节制增长的顾虑。进一步的研究要在糖尿病动物模型中开展，以观察人导管源性细胞在体内转化为有活性的β细胞的能力。

自人类胰岛移植开始，大量的基础和临床工作已经将细胞治疗糖尿病由理论变为了现实。但人类胰岛移植仍然是唯一的器官组织用以改善患者的胰岛功能，可惜的是目前仍受到供体短缺和长期免疫抑制剂治疗的困扰。猪胰岛移植是目前关注的异种异体胰岛移植的热点，但需消除移植后的安全隐患并利用微囊化技术提供持续的胰岛功能。部分团队致力于多能干细胞治疗糖尿病的领域，通过大鼠研究已证实了其治疗潜能，目前正在进行的临床试验，将进一步揭示其安全和治疗的可行性问题。最后，胰腺的内分泌和外分泌细胞具有潜在的治疗可塑性，其可能作为兼性祖细胞为机体提供β细胞来源。

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Research progress of diabetes cell therapy

Liu Ying, Jiang Xia. Department of Endocrinology, the First Centre Hosipital, Tianjin 300192, China

Jiang Xia, Email:jiangxia9698@126.com

Diabetes cell therapy can restore β cell function and provides the possibility to cure diabetes. Islet transplantation can achieve stable blood sugar level and is well tolerated. It also improves blood sugar metabolism, prevent the development of complications, and improve the quality of life. But the scarcity of donor pancreas and the need for long-term immunosuppression make the researchers to seek solution from pluripotent stem cells（PSCs）, which have the potential to reverse diabetes in diabetic mice. However, safety is the Achilles' heel of PSCs. In recent years, pancreatic progenitor cells were shown to stimulate acini cells or α cells to differentiate into β cells, which can provide a new effective method for diabetes treatment.

Diabetes； Pancreas； Islet transplantation； Pluripotent stem cells；Cell transdifferentiation

2016-07-26）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.011

300192 天津市第一中心医院内分泌科

江霞，Email：jiangxia9698@126.com

刘英,江霞.糖尿病细胞治疗的研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版）, 2017, 7(1):59-63.