桑黄水提物抑菌作用的研究与应用

王钦博，杨 焱，齐晓彦

（1乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司，上海 200436；2农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，国家食用菌工程技术研究中心，上海 201403）

桑黄水提物抑菌作用的研究与应用

王钦博1，杨 焱2，齐晓彦1

（1乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司，上海 200436；2农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，国家食用菌工程技术研究中心，上海 201403）

桑黄（Phellinus baumii.）是一种食药用真菌，利用沸水可提取其子实体抑菌成分。通过选取乳制品中常见的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同浓度的桑黄水提物对革兰氏阳性菌、阴性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究发现：桑黄水提物在1—10 mg/mL作用浓度下，实现了对牛乳中有害细菌、真菌有效的抑制，能显著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化，同时对有益菌无显著影响，相对Nisin等抑菌剂具有广谱抑菌性。

抑菌；桑黄；霉菌；酵母；细菌

随着国民经济的不断提高，我国乳品行业已步入了快速发展时期，消费市场对乳制品的品质要求也在不断提高。开发针对不同消费人群的、具有特殊生理功能的高品质乳制品成为我国乳业发展的一个新方向。而目前国内外乳品微生物污染事故频发，如2000年日本雪印旗下三款产品检出金黄色葡萄球菌超标，2002年美国惠氏生产的乳粉被检出阪崎杆菌超标等［1］。由于乳制品中含有丰富的营养成分，包括蛋白质、脂质、乳糖、维生素等，在乳制品的生产流通以及储存过程容易受到微生物的污染。因而，抑菌问题成为开发特色高品质乳制品重要的环节之一。

乳制品的抑菌方式主要有内源成分抑菌和外源物质添加抑菌［2］。如目前研究最深、应用最广的是乳酸链球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害细菌［3］，特别是耐热的芽孢杆菌及梭菌的生长和繁殖，以达到延长不同乳制品货架期的目的。Nisin能够有效控制革兰氏阳性菌的生长繁殖，但对革兰氏阴性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，与乳制品内源性抑菌物质相比，外源添加抑菌成分有作用范围小、不具广谱抑菌性的弊端。开发一种天然、安全的外源抑菌成分应用于乳制品的抑菌具有重要的意义。

桑黄（Phellinus spp.）作为一种珍贵的传统食药用真菌，是国际认同的食品领域中相率最高的一种食药用真菌［6-7］。目前，对于桑黄子实体水提物的生物活性有诸多报道，如抗氧化［8］、抗肿瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纤维化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通过研究桑黄子实体水提物的抑菌性，并应用于乳制品，考察桑黄子实体水提物对保鲜乳中菌群总数的影响，旨在为开发一种天然、安全、性能佳的乳制品抑菌剂做部分基础工作。

1 材料与方法

1．1 原料与仪器

PDA培养基、肉汤培养基购于国药集团，按药品说明取固体粉末加去离子水溶解后，121℃灭菌15 min后，待用；MRS培养基、M17培养基购于德国默克公司，按药品说明取固体粉末溶解后，121℃灭菌15 min后，待用；指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、宋内氏志贺氏菌（Shigella Castellani）、沙门氏菌（Salmonella）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌种（Saccharomyces cerevisiae）保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）以及双歧杆菌（Bifidobacterium），以上菌种保存于光明乳业股份有限公司菌种库；桑黄（Phellinus baumii.）保存于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心。

Bioscreen全自动生长曲线分析仪，购于芬兰Bioscreen公司；高压蒸汽灭菌锅HVE-50，购于HIRAYAMA公司；超净工作台TH-CB-402，购于LABCONCO公司。

1．2 桑黄水提物的制备

将桑黄菌种栽培得到子实体后，将子实体粉碎至约1 cm3的颗粒，在干燥的子实体粉碎物中加入20倍体积的去离子水，沸水提取2 h，滤得残渣进行二次提取；合并两次提取液并进行浓缩，4 000 r/min离心10 min去除沉淀；将乙醇加入浓缩液中，至乙醇终浓度为90%，室温下静置24 h后，将离心后沉淀部分加去离子水溶解，再次离心去除不溶物质；将上清进行透析12 h，透析后溶液进行冷冻干燥，即得桑黄水溶性提取物，115℃灭菌15 min后使用。

1．3 革兰氏阴性菌抑制试验

抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大肠杆菌、宋内氏志贺氏菌、沙门氏菌分别进行菌种复苏后，将菌体接种于液体肉汤培养基37℃下振荡培养18 h，调节培养后菌液中菌种浓度为105—106个/mL，取1 mL调节后菌液与呈液态的肉汤琼脂培养基混合均匀后倒至培养皿中；待培养基凝固后，将20 μL不同浓度桑黄水提物溶液滴在混有有害微生物的固体培养基上，以20 μL无菌水作为对照组；37℃下静置培养48 h后测量平板抑菌圈大小。

1．4 革兰氏阳性菌抑制试验

抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌分别进行菌种复苏，其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。

1．5 霉菌抑制试验

参照文献［15］的方法，并略做改动。将灭菌后桑黄水提物与PDA培养基混合均匀，使桑黄水提物终浓度为0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固体培养基为对照；取青霉、白霉菌株分别进行活化并进行固体扩大培养，7 d后分别挑取青霉、白霉菌种于平板中心，30℃培养7 d后，分别测量青霉、白霉在平板中的直径。

1．6 酵母生长抑制试验

取啤酒酵母菌种进行复活，挑取活化后的酿酒酵母扩大培养，调节酵母菌体浓度为105—106个/mL并取180 μL酵母发酵液与20 μL桑黄水提物溶液均匀混合，置于Bioscreen10×10孔板，使样品终浓度分别为4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以无菌水作为空白对照，30℃连续震荡，宽波长于600 nm吸光度，间隔20 min读数，连续测定2 000 min。

1．7 巴氏杀菌乳菌群总数的控制

将灭菌后的桑黄水提物与新鲜牛乳混合均匀，使样品在牛乳中的终浓度为0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均质后进行巴氏杀菌，置于10℃下保存，按国标“GB 47892—2010食品安全国家标准”方法测定牛乳中细菌总数，连续测定2周。

1．8 有益菌的影响

抑菌方法参照ZHAO［14］并稍作改动。取桑黄水提物分别用无菌去离子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亚乳杆菌（MRS培养基）、嗜热链球菌（M17培养基）以及双歧杆菌（MRS培养基）三种有益菌株复苏扩大培养，其余步骤参照“1.3革兰氏阴性菌抑制试验”。

2 结果与分析

2．1 革兰氏阴性菌的抑制结果

抑菌圈大小可反映抑菌保护剂抑菌能力，抑菌圈越大，抑菌能力越强（表1）。当不同浓度桑黄水提物作用下，混有有害微生物的平板出现抑菌圈，且抑菌圈随样品作用浓度的升高，直径也不断扩大；桑黄水提物对志贺氏菌抑制作用较弱，对于大肠杆菌的抑制较为明显，在1 mg/mL作用浓度下，即对大肠杆菌的生长具有抑制作用。由此可得出结论，桑黄水提物能有效抑制革兰氏阴性菌生长，但对不同细菌抑制程度有所不同。

表1 不同浓度桑黄水提物对阴性菌的抑制Table 1 The inhibition of gram-negative bacteria after adding aqueous extracts

2．2 革兰氏阴性菌的抑制结果

不同浓度桑黄水提物作用下，混有有害微生物金黄色葡萄球菌、李斯特菌、藤黄微球菌以及枯草芽孢杆菌的平板均可以观察到抑菌圈。抑菌作用具有样品浓度依赖性，随样品浓度的升高，抑制作用加强。样品在低浓度范围对藤黄微球菌作用不明显；相对样品对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制作用较为显著。

表2 不同浓度桑黄水提物对阳性菌的抑制Table 2 The inhibition of gram-positive bacteria after adding aqueous extracts

2．3 霉菌生长抑制情况

将不同浓度桑黄水提物混入PDA固体培养基，将白霉、青霉菌落置于平板中心，对霉菌生长的抑制作用与霉菌生长圈直径大小呈负相关（表3）。样品作用下，霉菌生长圈直径相对于空白对照缩小，且霉菌生长圈直径随着作用剂浓度增大而缩小。10 mg/mL作用浓度下，生长圈直径分别为空白对照直径的16.2%、40.6%，因而样品可有效抑制霉菌的生长。

2．4 酵母生长抑制情况

酵母等微生物在培养液中繁殖都能产生浊度。利用Bioscreen全自动生长曲线分析仪测定酵母生长过程中吸光值的改变，反映其生长速度及菌体浓度等。从图1可以看出，在桑黄水提物的作用下，对酵母的生长出现了抑制作用，且随作用浓度的升高，最大吸光值越小，酵母生长周期最高菌体浓度越低。

表3 不同浓度桑黄水提物对霉菌生长的抑制作用Table 3 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of mold

2．5 巴杀保鲜乳中菌群生长抑制情况

随着桑黄水提物浓度的提高，保存相同时间的保鲜牛奶乳中菌群总数越低，10 mg/mL作用浓度下，10℃保存14 d的巴杀鲜乳菌群总数最高未超过2×104cfu/mL。可见，桑黄水提物能有效控制保鲜牛奶乳中菌群总数，起到延长货架期的作用。

图1 不同浓度桑黄水提物对酵母生长的抑制作用Fig．1 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of yeast

图2 不同浓度桑黄水提物对细菌生长的抑制作用Fig．2 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of bacteria

2．6 有益菌生长作用情况

选取乳制品中常见有益菌进行试验，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌并没有产生可见的抑菌圈，只有在浓度较高时才在双歧杆菌平板上观察到较小的抑菌圈（表4），所以本发明的抑菌保护剂对有益菌无显著抑制作用。

表4 桑黄水提物对有益菌的作用Table 4 The influence of different concentration aqueous extracts of probiotics

3 结论与讨论

由于不同乳制品中成分较为复杂，添加菌种类别、奶源成分比例、加工方式、生产设备等均存在差异，因此很难用统一的抑菌方法应用到乳品企业生产中。目前多数乳品企业通过改变生产工艺、提高原奶的品质来达到延长货架期的目的，现有澳大利亚乳企将巴氏杀菌乳从原有21 d保质期，通过生产工艺改造将货架期延长至45 d。另有乳企通过添加天然、安全的抑菌成分的方式，延长保鲜乳制品的货架期，但目前食品标准允许添加的抑菌成分较少，且不具有广谱抑菌性。应当寻求多种保鲜技术的协同作用的方式，以达到抑制乳制品中有害微生物生长的目的。

本试验以食药用真菌桑黄（Phellinus baumii.）子实体为研究对象，使用沸水提取的方法，提取子实体中具有抑菌性的物质。研究分析了该水提物抑菌特性，分别选取了乳制品中具有代表性常见的几类微生物进行抑菌试验。桑黄子实体水提物对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌以及酵母均有不同程度的抑制作用。对大肠杆菌等革兰氏阴性菌，在1 mg/mL作用浓度时表现出了抑菌性质，但对志贺氏菌作用不明显；对于金黄色葡萄球菌等阳性菌，抑制效果较佳，在较低浓度0.5 mg/mL作用浓度下，即对部分阳性菌表现抑菌活性。酵母、霉菌是乳制品生产、运输、存放方程中，常见微生物污染源，本研究中考察了在桑黄水提物不同作用浓度下，有效抑制了酵母和霉菌的生长，一定程度上延长了保鲜牛乳的货架期。另外，本研究发现，桑黄水提物对牛乳中有益菌的影响除在50 mg/mL高浓度作用下，对双歧杆菌出现轻微抑制现象，但对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌不存在显著抑制作用。因此，1—10 mg/mL桑黄水提物在不抑制有益菌生长的前提下，实现了对牛乳中有害细菌、真菌有效的抑制，能显著控制巴杀牛乳中菌群总数的变化，相对Nisin等抑菌剂具有广谱抑菌性。

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（责任编辑：张睿）

Study and application of aqueous extract from Phellinus baumii on antibacterial activities

WANG Qin-bo1，YANG Yan2，QI Xiao-yan1（1State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy＆Food Co.，Ltd，Shanghai 200436，China；2National Engineering Research Center of Edible Fungi，Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Phellinus sp.is a highly-valued medicinal mushroom.Antimicrobial constituents were extracted through the boiling water.The typical harmful indicators bacteria existed in dairy products were selected.The different concentrations of the sample were studied in the bacteriostatic action of bacteria，yeast and mildew.The results showed that the Phellinus baumii aqueous extracts restrained the growth of harmful bacteria，mold and yeast in milk effectively under the 1—10 mg/mL concentrations.The total numbers of bacteria in milk were effectively controlled.At the same time there was no harm to the beneficial bacteria，the sample has a broad spectrum antimicrobial resistance compared with Nisin.

Phellinus baumii；Antibacterial activity；Yeast；Mildew；Bacterium

S567.3

A

1000-3924（2016）06-064-05

2015-12-01

十二五科技支撑计划课题（2012BAD28B07）新型乳制品的研发与产业化示范

王钦博（1984—），男，硕士，工程师，从事乳制品发酵剂及活性研究。E-mail：wangqinbo524＠163.com