IL28B基因多态性与聚乙二醇干扰素ɑ治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎24周疗效的关系

黄利坚 徐振兴 王国亮 杨嘉恩

厦门市中医院肝病中心，福建厦门 361001

IL28B基因多态性与聚乙二醇干扰素ɑ治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎24周疗效的关系

黄利坚 徐振兴 王国亮 杨嘉恩

厦门市中医院肝病中心，福建厦门 361001

目的探讨IL28B基因多态性（SNP）与聚乙二醇干扰素ɑ（PegIFNα）24周疗程治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎（CHB）疗效的相关性。方法采集398例接受PegIFNα24周疗程治疗HBeAg阳性CHB患者的外周血，采用直接测序法检测IL28B基因3个SNP位点rs12980275、rs12979860、rs8099917的多态性。应答定义：谷丙转氨酶（ALT）复常、HBV DNA＜500IU/mL、HBeAg血清转换。结果治疗总应答率为42.46%（169/398），HBV基因B型52.01%（207/398），C型47.99%（191/398）。IL28B 3个SNP位点的基因型在应答组与无应答组中的分布无显著性差异（P＞0.05），rs12980275 AA型与非AA型应答对比（OR0.916，95%CI0.460～1.825，P=0.804），rs12979860 CC型与非CC型应答对比（OR0.921，95%CI0.442～1.921，P=0.826），rs8099917 TT型与非TT型应答对比（OR0.921，95%CI0.442～1.921，P=0.826）。结论IL28B的SNP与聚乙二醇干扰素24周的治疗应答无显著相关。

慢性乙型肝炎; IL28B基因；干扰素；单核苷酸多态性；应答

我国慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者众多约有2000万例[1]，乙型肝炎病毒（hepatitis B virs，HBV）以B、C型为主，多系母婴传播，为治疗增加难度。据报道48周疗程聚乙二醇干扰素ɑ（peginterferon alpha，PegIFNα）治疗HBeAg阳性CHB患者HBeAg血清学转化率为32%～36%[2]。干扰素为临床一线抗病毒药物，干扰素疗程24周是重要的时间节点，2015年版我国慢性乙肝防治指南指出，HBeAg阳性CHB患者接受PegIFN-ɑ治疗24周时若HBsAg＜1500IU/mL，则继续单药治疗至48周可获得较高的HBeAg血清阴转率。临床医师或依据干扰素24周疗程时不同应答疗效采用应答指导治疗策略（responsed guided therapy，RGT），为确定下一步治疗方案提供参考[3]。2011年EASL 慢性丙型肝炎感染诊治指南增加了IL28B宿主基因型对抗病毒治疗疗效的重要的预测因素。慢性HCV感染与慢性HBV感染有着相似的发病机制。有国内外学者研究认为IL-28B SNP（single nucleotide polymorphism）位点与PegIFN-ɑ治疗48周的HBeAg血清学高转换率有关[4-5]。对于IL28B的SNP与乙型肝炎病程的转归、HBV感染后肝炎肝硬化、肝癌及IFN抗病毒疗效的相关研究，国内外学者均有不同见解，这可能与选择不同的实验方法及针对不同的患者种族有一定的关系，尚需进一步研究明确IL28B的SNP与HBV的相关性[6]。IL28B的 SNP与24周干扰素疗效的相关性尚未明确。我们参照2010年我国慢性乙型肝炎防治指南诊断标准[7]，选择初次接受PegIFNα抗病毒治疗的HBeAg阳性的CHB患者，依据24周疗程的应答疗效，结合临床基线水平，探讨IL28B的 SNP与干扰素治疗慢性乙肝的24周应答疗效的相关性，为选择预测IFN的早期应答指标提供参考，为选择后续抗病毒方案提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

样本量估算：参考文献结果[8]，rs12980275基因型AA应答率 38.0%，N-AA（AG/GG）应答率21.3%；rs12979860基因型CC应答率 38.6%，N-CC（CT/TT）应答率 21.7%；rs8099917基因型TT应答率 38.7%，N-TT（TG/GG）应答率 20.5%；检验水准取0.05，检验效能取0.8，自由度为2，双侧检验，兼顾到不超过15%的脱失和失访率，故拟纳入初治的HBeAg阳性慢性乙型肝炎病例合计需要400例。我们随机选择2013年10月～2015年10月于厦门市中医院肝病中心就诊的接受初次抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者400例，签署知情同意书。接受PegIFNα治疗，疗程中有2例患者出现甲状腺机能异常停药，最终统计病例398例。诊断标准：参照2010年中华医学会肝病学会发布的我国慢性乙型肝炎防治指南[7]。HBeAg阳性CHB的诊断标准：（1）HBsAg阳性；（2）；HBeAg阳性、抗HBe阴性；（3）HBV DNA阳性（≥500IU/ mL）；（4）ALT持续或反复升高（ULN 0-40 IU/L）；（5）肝穿刺活检显示肝组织炎症活动度（分级≥G2或/和肝组织纤维化分期≥S2）[7]。

排除标准：具有下列任何1项者：（1）肝炎肝硬化；（2）血清总胆红素≥3×ULN或直接胆红素≥2×ULN；（3）合并自身免疫性疾病：甲状腺机能亢进症、甲状腺炎、红斑狼疮、肾炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等；（4）合并严重心脏病；（5）合并精神疾病；（6）合并糖尿病或糖耐量异常；（7）合并其他较严重疾病；（8）合并其他肝炎病毒感染或HIV感染；（9）妊娠，或拟1年内妊娠；（10）近6个月内曾接受抗病毒治疗或免疫调节治疗；（11）研究者认为依从性差。

1.2 治疗方法

PegIFNα-2b每次100μg皮下注射，每周1次；或PegIFNα-2α每次180μg皮下注射，每周1次；疗程24周后观察是否达到应答标准。

1.3 研究设立两组观察比较

（1）应答组：ALT复常、HBV DNA＜500IU/mL、HBeAg血清转换。（2）非应答组：为未达到以上标准。

1.4 统计学分析

2 结果

所有病例治疗前签署知情同意书，完成肝穿活检病理检查，留取外周血检测IL-28B 3个SNP位点RS8099917、RS12979860、RS12980275的多态性，及乙肝病毒基因型，血常规、生化学、乙肝病毒学：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBeAb、HBcAb，HBV DNA定量检测。

2.1 血常规、生化学检测

Beckman Coulter LH-750型全自动血细胞分析仪进行血常规检测。Beckman Coulter LX-800型全自动生化分析仪进行肝功能相关指标检测。

2.2 HBV血清标志物（HBVM）

HBsAg、HBsAb、HBeAg和HBeAb、HBcAb：采集患者的静脉血液并分离出血清，按照罗氏Roche cobas e601型电化学发光分析仪检测。其中HBsAg定量线性为：0.05 ～ 51200IU/mL。

2.3 HBV DNA定量

采集患者的静脉血液并分离出血清，按照安普利 Gene Light 9800的操作步骤进行检测。

2.4 全血标本IL28B基因多态性检测及HBV基因分型检测

2.4.1 核酸提取 实验仪器：天隆NP968核酸提取仪。实验耗材：天隆磁珠法核酸提取耗材TLHC003。试剂：天隆RNA/DNA提取试剂盒ZTLJB-Y64（磁珠法）。检测流程：按照说明书加入蛋白酶K及待测样品后，由核酸提取仪自动提取核酸样品（病毒核酸与人基因组由此步共提）。

2.4.2 IL28B基因多态性检测 实验仪器：Biorad C1000 Thermal Cycler Biorad电泳仪；试剂：10mM dNTP混 合 液（Takara）；PFU酶；10*PFU Buffer；引物（生工生物）；DEPC水；琼脂糖；核酸凝胶电泳Loading Buffer。检测流程：采用直接测序的方法对标本的基因多态性及HBV基因型进行检测，巢PCR扩增的流程：第一轮（配液体系）：10*PFU buffer 2ul；10mM dNTP 0.4μL；正向引物 0.4μL；反向引物 0.4μL；PFU 0.2μL；模板 5μL；DEPC水补齐至总体积为20μL。扩增条件为：95℃10min；（94℃40S，53℃ 40S，72℃ 60S）×35times；72℃10min。第二轮（配液体系）10*buffer 5μL；10mM dNTP 1μL；正向引物 1μL反向引物 1μL；PFU 0.5μL；模板 2μL；水补齐至总体积为50μL。扩增条件为：95℃10min；（94℃40S，53℃40S，72℃60S）×35times；72℃10min。引物信息见表1。

表1 引物信息

阳性PCR产物送测序，IL28B SNP基因型根据测序峰图直接判读基因型。HBV基因分型利用MEGA 5.0 构建NJ进化树进行分型，核酸阴性标本则以免疫学分型结果为准（见第三部分）。

2.4.3 HBV免疫学分型 ELISA双抗夹心法。仪器：电热恒温培养箱；安图PHOMO酶标仪。实验流程：包板：分别包被HBV-16D12、HBV-6H3，每孔包被400ng，4℃包被过夜，洗板1次并甩干。NRA/HIV封闭液37℃封闭2h，洗板一次并甩干。检测：加入10μL待测样品和90μL 20% NBS，37℃温育1h，洗板5次并甩干；加入酶标二抗SF-HRP（1∶2000稀释），37℃温育30min，洗板5次并甩干；显色，终止，读值。HBV-16D12阳性为B型，HBV-6H3为C型。

2.5 肝穿活检

入选患者排除肝穿刺禁忌症，签署有创检查知情同意书。超声定位穿刺点，局部浸润麻醉，超声指引下用16G穿刺针采用1秒快速穿刺活检，取长约2.0cm肝组织送检。标本10%甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，经苏木精红（HE）染色及网状纤维染色、Masson染色，制成4μm切片镜检，高年资病理医师诊断。病理诊断参照2010年中华医学会肝病学会发布的我国慢性乙型肝炎防治指南。

2.6 检测结果

上述检测指标中，治疗初期完成肝穿活检及检测IL28B的SNP位点及HBV基因型，其余指标分别于治疗初期、疗程每个月末时检测。见表2～6。

表2 IL28B的SNP基因型分布

通过表3中的3组数据比较，IL28B SNP基因型TT对比N-TT，CC对比N-CC，AA对比N-AA，在PegIFNα 24周应答组与无应答组的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

由表4可见，基线HBVDNA应答组（6.9±1.3）log10IU/mL，无应答组（7.2±1.2）log10IU/mL，两者对比差异有统计学意义（P＜0.05）。基线ALT应答组（5.9±4.1）×ULN，无应答组（4.9±3.6）×ULN，对比差异有统计学意义（P＜0.05）。基线HBVDNA低水平、基线ALT高水平与高应答相关。

表3 IL28B SNPs与PegIFNα24周应答的比较

表5 IL28B单体型与应答的关系

3 讨论

慢性乙型肝炎的治疗是长期的过程，清除HBV是治疗的关键问题。HBV的治疗以干扰素（IFN）为首选药物，IFN分为1型（IFNα和β）、2型（IFNγ）和 3型（IFNλ）[9]。IL28B基 因 编码3型IFNλ（IFNλ3），与IFNλ1（IL29编码）及IFNλ2（IL28A 编码）共同组成IFNλ家族。IL28A、IL28B及IL29基因位于第19号染色体，彼此紧密相邻。根据分子结构，3型IFN属于白介素10超家族成员，但在功能上与1型IFN密切相关，具有抗病毒免疫调节作用。1型和3型IFN分别与细胞表面不同的受体结合，但进入细胞后的信号传导通路相同，即通过JAK-STAT信号通路诱发IFN激活基因表达，这可能是IL28B基因多态性和IFN抗病毒疗效相关的基础。干扰素疗效个体差异较大，对于HBeAg阳性CHB患者，PegIFN 个体化治疗的选择指征包括HBV基因型（A＞B＞C＞D）、HBV DNA水平（≤109IU/mL）、ALT水平（＞2×ULN）、病毒基因组（野毒株或前C区PC/核心启动子BCP）、肝病严重程度（代偿期）、年龄（较轻）、IL-28 B基因型（AA或CC）。宿主的遗传背景与机体抗病毒免疫密切相关，由于遗传的异质性导致临床表现的复杂性。基因遗传研究的根本在于研究探寻基因型（geno-type）与表现型（phenotype）的相关性。临床基因诊断的策略：识别遗传指标信息、临床评估、临床诊断、选择合适的基因检测、分析得到表型关联的基因变异结果，得出临床相关性分析和遗传咨询。Raglow等[10]研究认为肝脏中干扰素刺激基因（ISGs）其IL28B型表达明显不同，为干扰素的不同治疗选择提供依据。机体长期感染HBV发病后，抗病毒免疫状态极为复杂，涉及HBV病毒学如HBV的PC/BCP变异、机体免疫动力学，研究提示治疗初期ALT高水平与PegIFNα疗效密切相关，而治疗初期低HBVDNA水平与机体免疫动力释放相关。IL28B基因可通过降低HBV载量及调控肝脏炎症来控制HBV感染的结局[8]。这与本研究观察结果一致，治疗初期慢性乙肝患者ALT高水平、低HBVDNA水平与干扰素应答密切相关（P＜0.05）。本研究观察发现IL28B的SNP基因型AA对比N-AA（P=0.804，OR0.916，95%CI0.460～1.825），CC对比N-CC（P=0.826，OR 0.921，95%CI0.442～1.921），TT对比N-TT （P=0.826，OR0.921，95%CI0.442～1.921），均发现SNP基因型在应答组与无应答组中分布无显著性差异（P＞0.05）。IL28B的SNP单体型在应答组与无应答组中分布的比较，CT型（P=0.483，OR1.288，95%CI0.635～2.613）， TG型（P=0.944，OR0.974，95%CI0.466～2.034），无显著性差异（P＞0.05），发现SNP单体型CT型、TG型与应答无显著相关。统计以上结果提示IL28B的SNP与PEG-IFNα 2 4周应答无显著相关性。然而，IFN治疗后HBV下降及肝脏炎症改善是一个逐步改变且较长时期的过程，IL28B对机体内源性IFN的调控过程较长且机制较为复杂，有学者研究认为延长干扰素疗程治疗慢性乙肝效果更好[11]，其他学者采取个体化干扰素治疗亦获得更好的应答疗效[12]，PegIFNα24周的疗程应答疗效并不能充分体现IL28B的SNP与干扰素应答可能存在的相关性，应做进一步研究，观察48周或更长疗程，或采用个体化治疗观察干扰素疗效，以得出更为完善的最终评价。

综上所述，本研究发现IL28B的SNP与PEGIFNα24周疗效无明显相关性，并不适合作为预判PegI-FNα的早期应答疗效指标。IL28B的SNP与 PegIFNα更长时期疗程及个体化疗程的相关性有待进一步探讨研究。但本研究未对乙肝病毒基因组（野毒株或PC/BCP）做进一步检测、未检测IL28B次要基因型rs11881222及rs10853728、未纳入肝炎肝硬化患者，可能对统计数据造成一定的影响。

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Investigation whether IL28B polymorphisms could affect the response of 24weeks treatment of Peginterferon alpha（PegIFNα）in chronic hepatitis B HBeAg-positive patients

HUANG Lijian XU Zhenxing WANG Guoliang YANG Jiaen
Center of Liver Disease, the TCM Hospital of Xianmen City, Xianmen 361001, China

ObjectiveTo investigate whether IL28B polymorphisms could affect the response of 24weeks treatment of Peginterferon alpha(PegIFNα) in chronic hepatitis B HBeAg-positive patients.MethodsA total of 398 hepatitis HBeAg-positive patients with 24week treatment of PegIFNα were enrolled in the study.Genotype analysis was performed for IL28B rs12980275,rs12979860 and rs8099917 using the direct sequencing method. Response was defined as cases showing normal aminotransferase(ALT) levels,HBV DNA level＜ 500IU/mL and HBeAg seroconversion.ResultsThe patients were infected with hepatitis B virus(HBV) genotype B(52.01%) and C(47.99%) With a total response rate of 42.6%.For the three SNPs,there were not significant differences between the response(R) and non- response(NR) groups in genotype distribution(P＞0.05). IL28B genotype at rs12980275 with R for AA versus N-AA(OR 0.916,95%CI 0.460-1.825, P=0.804), rs12979860 CC versus N-CC(OR 0.921,95%CI 0.442-1.921,P=0.826) and rs8099917 TT versus N-TT(OR 0.921,95%CI 0.442-1.921,P=0.826).ConclusionPolymorphisms in IL28B were not significant differences of response with 24weeks treatment of PegIFNα in HBeAgpositive CHB patients .

Chronic hepatitis B; IL28B; Peginterferon; Single nucleotide polymorphism; Treatment response.

R575.1

A

2095-0616（2016）19-13-05

2016-07-26）

福建省厦门市科技计划项目（3502Z20134021；厦科联[2013]27号）。