EDTA依赖的假性白细胞减少的实验分析与纠正对策

陈龙 徐旭栋 张永为 陆新建 肖湘阳 王剑超⋆

EDTA依赖的假性白细胞减少的实验分析与纠正对策

陈龙 徐旭栋 张永为 陆新建 肖湘阳 王剑超⋆

目的 研究EDTA依赖的白细胞聚集对血液分析仪检测结果的影响，探讨抗凝剂介导的白细胞聚集的可能机制和白细胞计数纠正方法。方法 统计与分析2014年10月至2016年10月345600例门诊、住院血常规标本发生EDTA诱导的白细胞聚集导致假性白细胞减少例数的相关情况。结果 共发生EDTA依赖的白细胞聚集7例，其它原因导致白细胞聚集27例，发生率分别为0.002%和0.008%。由于白细胞聚集导致仪器自动白细胞计数结果假性偏低，与人工显微镜计数结果比较差异存在统计学意义（P＜0.01），进一步的实验表明EDTA诱导的白细胞聚集在37℃水浴30min和更换枸橼酸钠抗凝剂后白细胞聚集情况未得到纠正，相较于白细胞人工镜检计数差异有统计学意义（P＜0.01），而标本采用仪器稀释液与标本血浆等量置换以及标本中加入卡那霉素20mg/ml方法后，标本中白细胞聚集现象得到部分纠正，但仪器结果与人工镜检计数差异仍存在统计学意义（P＜0.01）。结论 EDTA抗凝剂诱导的假性白细胞减少发生率为 0.002%，极易漏诊。发现有白细胞聚集的情况应采用人工显微镜计数进行检测结果纠正，以防发生误诊误治。

假性白细胞减少 EDTA 白细胞聚集

在日常的临床检验工作中，全自动血球计数仪因其快速准确的优点而得到广泛应用，标本静脉抗凝血，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2），因其对红白细胞影响较小，并可抑制血小板在体外聚集等优点已被国际血液学标准化委员会作为认定的血液抗凝剂而广泛使用。尽管如此，关于EDTA-K2抗凝血可引起血小板聚集导致假性血小板减少（PTCP）现象已被大家普遍认知［1］，然而关于EDTA诱导的假性白细胞减少现象却少有报道，这种现象容易导致检验结果的错误发生，导致临床上假性白细胞减少［2］。因此，作为从事检验工作者，应该对这类现象给予高度重视，为了得到准确的检测结果，必须留心观察并排除干扰细胞分析的因素，不可完全依赖仪器的检测结果。现将本科室在过去两年中遇到的7例EDTA抗凝剂诱导白细胞聚集导致的白细胞减少现象进行分析研究，以期为检验人员在日常工作中遇到此类现象进行纠正提供实验依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集本院2014年10月至2016年10月间门诊和住院患者外周血液样本 345600例，通过人工显微镜观察和血涂片瑞士染色镜检证实得到符合白细胞假性减少病例34例，然后采用37℃水浴等方法证实34例假性白细胞减少标本中与温度相关因冷凝集素等诱导白细胞聚集而导致的假性白细胞减少27例，其余7例无论是采用37℃水浴还是更换抗凝剂均不能纠正仪器白细胞假性减少现象，但该7例患者通过采末梢血（未加EDTA抗凝剂）进行仪器白细胞计数（WBC）与人工显微镜WBC结果未见明显差异。对此7例病例标本进行总结分析，其中男4例，女3例；年龄15～76岁，中位年龄49岁，7例患者标本分别来自肿瘤科1例，血液科2例，心内科1例，内分泌科2例，呼吸科1例。

1.2 检测仪器 血常规用Coulter LH 750血液分析仪检测，采用原装配套的试剂及质控品，当日机器运转正常，质控品在质控范围。

1.3 实验方法与观察指标 使用Coulter LH 750血液分析检测，所有患者的仪器结果如触及科室制定的复检规则，均进行相应的人工复检。如涂片镜检发现白细胞聚集的异常标本除显微镜人工WBC（采末梢指血手工计数）纠正外，进一步采用37℃水浴30min﹑稀释液等量血浆置换［EDTA-K2真空抗凝管抗凝的全血标本低速（1000r/min）离心2min，用稀释液等量置换血浆，充分混匀后在血细胞分析仪上进行重测］﹑更换枸橼酸钠抗凝剂重新采集静脉血﹑静脉血标本中加入卡那霉素（20mg/ml）等不同方法预处理检测标本，观察其仪器WBC纠正效果。同时，观察与分析仪器白细胞散点图及VCS参数在EDTA依赖的假性白细胞减少标本中的变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 涂片镜检结果 34例不同原因导致假性白细胞减少病例，在油镜下可以观察到白细胞成团聚集现象。EDTA-K2抗凝剂诱导的白细胞聚集镜下仅见白细胞聚集，红细胞散在分布，冷凝集素导致的聚集，可以同时看到红细胞聚集现象。

2.2 两组（冷凝集等白细胞聚集组，EDTA诱导白细胞聚集组）不同预处理后仪器结果前后，及与手工计数结果比较 34例假性白细胞减少的白细胞聚集标本采用37℃水浴﹑血浆置换﹑更换枸橼酸钠抗凝剂﹑加卡那霉素等不同方法预处理后血细胞仪检测白细胞较之前纠正情况，发现37℃水浴对27例冷凝集等因素导致白细胞聚集标本具有显著改善作用，水浴前后仪器结果差异明显（P＜0.01），并且水浴过后仪器结果与人工末梢指血显微镜计数结果无统计学差异（P＞0.05），而同样方法下37℃水浴30min对另外7例由EDTA抗凝剂诱导的白细胞聚集现象不能起到纠正作用，水浴前后两次仪器结果无统计学差异（P＞0.05）；改用枸橼酸钠抗凝血对34例白细胞聚集标本基本均无改善作用；血浆置换方法对EDTA诱导的白细胞假性减低可以部分纠正，而对冷凝集等原因导致的基本可以纠正（P＞0.05）；加入卡那霉素对EDTA诱导的假性白细胞减少有一定的纠正作用，但对冷凝集导致白细胞假性减少几乎无作用。

3 讨论

EDTA-K2抗凝血发生白细胞聚集是一种罕见的血液现象，也可以导致仪器的WBC自动计数结果假性减低，国内外现已有相关个例报道［3-4］，但并不为大家熟悉和重视。有研究认为它的发生可能与恶性肿瘤﹑感染﹑肝病和自身免疫疾病等有关［5］，其机制可能与冷凝集素等异常蛋白增高有关。至于白细胞为什么会在EDTA抗凝剂中发生聚集尚不明确，可能与以下三个因素有关：（1）患者本身体质和疾病类型致使EDTA抗凝物质活化白细胞表面某些隐匿性表面抗原，使白细胞相互聚集。（2）EDTA- K2与血液中的钙离子结合形成螯合物，细胞内钙离子浓度发生变化从而导致白细胞变形聚集。（3）也有文献报道称致病因素﹑药物作用﹑阳离子抗凝剂等可导致白细胞间负离子减少，导致相互排斥力减低，距离缩短从而聚集在一起。

通过本次实验的几类方法对EDTA诱导的白细胞假性减少现象（排除冷凝集导致白细胞聚集现象）比较下来，临床工作中要想得到最为准确实验数据，避免误诊误治，遇到EDTA诱导的白细胞假性减少现象时，最好的方法还是重新对患者采用末梢指血（未抗凝）即时涂片瑞士染色人工显微镜镜检计数白细胞。

此外，在本次实验中作者还发现当白细胞聚集时，VCS技术参数相应发生显著变化。散点图与VCS参数能敏感地反映白细胞的形态学变化，其能敏感的检测出包括中性粒细胞﹑单核细胞﹑淋巴细胞等白细胞各个时期体积，胞核以及胞浆颗粒不同生理状态下的变化，在既往研究中白细胞散点图及VCS参数广泛应用于细菌性感染中心粒细胞﹑病毒感染及免疫应答淋巴细胞以及疟疾感染单核细胞的形态改变等研究中。当遇到EDTA依赖的假性白细胞减少标本时，白细胞散点图中淋巴﹑单核﹑中性粒等白细胞间相互重叠，无明确分界点，最终导致仪器对WBC分类产生误差，中性粒细胞被计数偏低，淋巴细胞和单核细胞比例假性增高，说明当白细胞成团聚集时细胞计数仪无法准确识别每一类细胞；VCS技术参数中的中性粒细胞平均体积（NMV）明显增大（P＜0.01），明显超过了正常范围。中性粒平均激光散射（MNS）及平均高频传导（MNC）在白细胞假性减少时明显减低（P＜0.01）。实验发现当白细胞聚集时中性粒细胞体积分布宽度（NDW）明显增高，因此可以考虑将NDW显著升高，作为白细胞聚集的一项参考指标。

［1］ 关向前,陈发珍．EDTA依赖性血小板聚集及其对血小板计数的影响． 临床输血与检验,2015,17(3):239-242．

［2］ Jean-Francois L,Xavier T．EDTA-dependent lymphoagglutination．Br J Haematol,2001,115(2):237．

［3］ 孙建新,王富江．中性粒细胞聚集引起白细胞计数假性减少1例．国际检验医学杂 志,2013,34(21):2942

［4］ Khalil SH．EDTA-dependent leukoagglutination． American Journal Of ClinicaPathology, 1991, 96 (1):147-155．

［5］ 杨大干,陆丽芬,李雪芬,等．外周血中性粒细胞低温聚集一例．检验医学,2005,20(2):108．

Objective To study the infl uence of EDTA Dependent Leukoagglutination on the white blood cell counting result by automated blood analyzer，the possible reason of WBC aggregation caused by EDTA anticoagulant and the way to correct its infl uence. Methods Statistics and analysis，from October 2014 to October 2016，345600 cases of outpatient and inpatient blood routine specimens，EDTA induced leukocyte accumulation，leaded to the number of cases of false white blood cells. Results It revealed that the incidence was 0.002%（7 cases among 345，600）of which had EDTA induced Leukoagglutination，27 cases（0.008%）had WBC clumping caused by other reasons. These 34 samples had spuriously low WBC counts due to WBC clumping compared to manual differential results（P＜0.01）. The Leukoagglutination caused by EDTA could not be corrected by incubating samples in 37℃ water bath for 30 mints or by replacing the EDTA by sodium citrate. The leukoagglutination caused by EDTA could be partially be corrected by diluting the sample with instruments diluent at a dilution of 1：1 and by adding kanamycin 20 mg/ml to samples，but still infl uence the white blood cell counting resulted by automated blood analyzer（P＜0.001）. Conclusion EDTA can induce WBC aggregation，and thus spuriously low WBC counts，our study shows that the incidence is 0.002%. Examination of a well prepared peripheral blood smear is mandatory for every case of leukoagglutination.

Pseudo leukopenia EDTA Leukoagglutination

310005 浙江中医药大学附属第二医院检验科*