东太平洋结核区可培养细菌的多样性研究❋

程景广，于 敏，戴晓风，张增虎，刘 娜，安 可，史晓翀，张晓华(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

东太平洋结核区可培养细菌的多样性研究❋

程景广，于 敏❋❋，戴晓风，张增虎，刘 娜，安 可，史晓翀，张晓华
(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

东太平洋结核区位于东北太平洋，在深海海底含有丰富的多金属结核，而微生物在多金属结核的形成过程中发挥着重要的作用。本研究通过DY29航次获得了该区域多个实验样品，包括结核、结核覆盖的沉积物、无结核覆盖的沉积物和底层海水，并对这些样品进行了细菌的分离培养和活性检测。结果表明，东太平洋结核区拥有丰富的微生物资源，共分离保藏细菌1 200株，其中402株细菌完成16S rRNA基因测序，分属于4个门，65个属和135个种。4个门分别为变形菌门(Proteobacteria，占81.59%)、放线菌门(Actinobacteria，占8.21%)、厚壁菌门(Firmicutes，占8.21%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，占1.99%)；优势属为盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)等。两种沉积物样品中可培养放线菌门和厚壁菌门的细菌丰度较高，结核中分离得到的细菌包含较高比例的α-变形菌纲，4种样品类型中γ-变形菌纲的细菌均占最大比例。对结核样品分离得到的细菌进行酶学性质检测发现具有过氧化氢酶及酯酶(吐温20和吐温40)活性的菌株所占比例较高，并首次筛选出一些未报道的具有锰氧化能力的菌株。综合以上结果，东太平洋结核区不同样品的可培养细菌多样性较高，微生物资源丰富，而具有锰氧化能力菌株的分离鉴定对研究深海多金属结核的形成及深海矿产资源的开发都具有重要的意义。

东太平洋结核区；可培养细菌；酶学性质；锰氧化细菌；16S rRNA 基因

深海锰结核是一种含有锰、铁、镍、钴和铜等多种金属的团状疏松矿石，又称为多金属结核，广泛分布于4 000～6 000 m的深海[1]。据估计全世界大洋海底的结核储量大约3万亿t，而仅太平洋的储量就有1.7万亿t，其次为印度洋和大西洋，其中克拉里昂-克里伯顿断裂带(Clarion-Clipperton Fracture Zone, CCFZ)位于东北太平洋，该区结核的丰度和品位最高，被认为是最具有商业价值的结核区[2-3]。

海洋中的微生物以数量大、种类多和适应能力强等原因备受关注，特别是深海的极端环境微生物，是目前研究的热点之一。深海环境一般为高压、低温、黑暗、高盐、寡营养，而生活在此生态系统中的微生物却具有丰富的物种多样性及功能活性。深海多金属结核区作为一种特殊的生态系统，其所孕育的微生物群落与其他地区有一定差异。深海微生物的分离培养一直是研究海洋微生物的基础内容，对研究微生物的生理学功能、系统进化关系和在生物地球化学循环中的作用具有重要的意义。

目前，采用培养方法对深海多金属结核区微生物种群组成的研究较少。史君贤等[4]对东太平洋铁锰结核区不同样品(水样，结核和沉积物)中铁锰相关细菌的丰度进行了比较，并分离出347株细菌，鉴定为11个属。近年来，越来越多的学者采用非培养方法研究了结核区不同样品的微生物群落结构，如Xu等[5]在2005年采用克隆文库法首次对东太平洋结核区沉积物样品的多样性进行了研究，发现变形菌门中的γ-变形菌纲为优势类群。Xu等[6]在2008年使用克隆文库法对东北太平洋结核区不同深度的沉积物样品进行了比较，发现不同深度的沉积物的优势类群也为γ-变形菌纲。Wang等[7]在2010年使用克隆文库法对CCFZ区四个站位的沉积物样品进行了比较，发现优势门均为变形菌门，但优势纲却各不相同。Wu[8]等在2013年使用克隆文库法对深海多金属结核样品和周围的沉积物样品进行微生物群落结构比较，发现沉积物样品的多样性比结核样品高。由此可见，利用非培养方法能够较好地了解深海多金属结核区的微生物种群组成，但由于无法获得纯培养的菌株，对于认识该区域微生物的生态功能还需要进一步通过可培养的方法进行研究。

多金属结核的形成需要生物与化学的协同作用[9-11]，然而迄今为止，深海结核的具体形成原因还不清楚，但越来越多的研究证实了多金属结核的形成离不开微生物，如阎葆瑞等[12]通过模拟试验论证了多金属结核的微生物成矿机制，Ehrlich等[13-15]做了大量工作研究细菌在锰结核形成过程中对锰离子的转化作用。本研究对多金属结核区中结核样品、结核覆盖的沉积物样品、无结核覆盖的沉积物样品和底层海水样品进行了可培养细菌的分离培养，研究了该区域微生物的多样性及基础代谢活性，并进一步分离鉴定出了具有锰氧化活性的菌株。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在2013年8—9月期间，通过参加由“科学六号”考察船所执行的“大洋29”航次科考，获得了大量CCFZ区样品。水样采用CTD采水器获取，选取的水样为底层水；沉积物采用抓斗式和箱式采泥器获得。使用R2A和2216E培养基进行现场涂布，将未涂布的样品置于4 ℃，带回实验室进一步处理。采样站位的经纬度及水深等数据如表1所示，采取的样品分为四种类型：底层海水、结核、结核覆盖的沉积物和无结核覆盖的沉积物。

1.2 菌株的分离、纯化及保藏

用无菌药匙挑取适量的沉积物样品或捣碎的结核样品置于生理盐水中，并分别进行10、100、1 000倍梯度稀释。将各稀释梯度的样品涂布于R2A、2216E和SPG-4[16]固体培养基平板，每个梯度2个平行，同时对水样进行类似的处理。为了筛选出具有锰氧化能力的菌株，将部分站位的样品涂布到K板[17]上，然后将涂布的平板分别置于4、10、和28 ℃恒温培养箱中培养。依据平板上菌株的大小、颜色和形态等特征挑取单菌落，划线纯化3次后接种斜面，用含15%甘油的保种液保种，并置于-80 ℃超低温冰箱中保藏。

1.3 菌株DNA的提取和16S rRNA基因测序

采用煮沸法或酚氯仿抽提法[18]提取菌株的基因组DNA。以通用引物B8F和B1510[16]对菌株16S rRNA基因进行扩增，PCR反应的条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，以限制性内切酶Hae III进行酶切，将酶切图谱不同的PCR产物委托北京六合华大有限公司进行测序。

1.4 根据16S rRNA基因序列进行菌株的分类鉴定及系统进化树的构建

将测序所得的16S rRNA基因序列与韩国标准菌数据库 (www.ezbiocloud.net)进行比对，根据相似度最高的序列确定菌株的分类地位。将所有菌株的16S rRNA基因序列(相同序列用其中一条取代)利用MEGA 6.0软件以邻接法构建系统进化树，自举法1 000次检测进化树的可靠性。

1.5 酶学性质的检测

将分离自结核样品的菌株分别检测以下酶学活性或生物活性：在接种有待测菌株的2216E平板上加入卢戈氏碘液以检测琼胶酶活性，有透明圈出现则结果为阳性；参照张晓华等的检测方法对菌株脂酶(吐温20、40、80)，明胶酶，β-半乳糖苷酶，藻胶酶和过氧化氢酶的活性进行检测[19]；以平板法(报告菌为根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens, A136)检测菌株是否能够产生密度感应(Quorum sensing, QS)信号分子[20]；参照tang等的检测方法对菌株的密度感应猝灭(Quorum quenching, QQ)活性进行检测[21]；在接种有待测菌株的K板上滴加LBB以检测其是否具有锰氧化活性，菌落显蓝色即结果为阳性[17]。

2 结果

2.1 菌株的分类鉴定

根据不同站位菌落的形态差异共分离保藏菌株1 200株，对这些菌株提取DNA后进行PCR扩增，根据PCR产物酶切图谱的不同，共402株细菌完成16S rRNA基因测序。经比对后，这402株菌分属于4个门，65个属和135个种。四个门分别为变形菌门(Proteobacteria)，共328株，占81.59%；放线菌门(Actinobacteria)，共33株，占8.21%；厚壁菌门(Firmicutes)，共33株，占8.21%；拟杆菌门(Bacteroidetes)，共8株，占1.99%。其中变形菌门的细菌属于α-变形菌纲和γ-变形菌纲，菌株数目和所占比例分别为126、 202和31.34%， 50.24%(见图1)。由此可见，γ-变形菌纲是分离获得的可培养细菌的主要类群。

属水平分析发现，可培养细菌的优势属为盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)、赤杆菌属(Erythrobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、副球菌属(Paracoccus)和海杆菌属(Marinobacter)等(见图2)。其中，庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacterpontiacus)在可培养细菌中所占比例最高(10.45%)，其他优势种包括南方盐单胞菌(Halomonasmeridiana)、麦氏交替单胞菌(Alteromonasmacleodii)、产类胡萝卜素副球菌(Paracoccuscarotinifaciens)、威尼斯不动杆菌(Acinetobactervenetianus)、柠檬色赤杆菌(Erythrobactercitreus)、昆明假单胞菌(Pseudomonaskunmingensis)和南海沉积物赤杆菌(Erythrobacternanhaisediminis)等(见图3)，上述优势种均属于变形菌门。

2.2 不同样品的可培养细菌类群比较

4种不同样品所分离得到的细菌种类与数目各异，其中结核样品中共分离得到110株菌，分属于40种；结核覆盖的沉积物样品共分离得到102株菌，分属于62种；无结核覆盖的沉积物样品共分离得到58株，分属于34种；水样分离得到132株，分属于46种。不同样品分离得到的最高丰度菌株如表2所示。在4种不同的样品中，结核覆盖的沉积物样品分离得到的菌株分属于3个门类，即变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，而除这3个门的细菌之外，其他3种样品中还分离得到了拟杆菌门的细菌(见图4)。相比其他样品类型，2种沉积物样品中分离出较多的放线菌门和厚壁菌门细菌，而结核中分离出较多属于α-变形菌纲的菌株，4种样品类型中γ-变形菌纲细菌均占最大比例。

(A：代表无结核覆盖的沉积物样品；B：代表结核覆盖的沉积物样品；C：代表结核样品，D代表水样。A: sediment samples overlaying nodules on its surface； B: sediment samples without overlaying nodules on its surface；C: nodule samples； D: bottom water samples.)

图4 不同分离样品各类群所占的比例

Fig.4 The proportion of each group from different samples

通过比较4种样品的菌株种类，发现威尼斯不动杆菌(Acinetobactervenetianus)、柠檬色赤杆菌(Erythrobactercitreus)、南海沉积物赤杆菌(Erythrobacternanhaisediminis)、南方盐单胞菌(Halomonasmeridiana)和庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacterpontiacus)在4种样品中均有分布，推测这五种菌在深海结核区的分布较为广泛。

2.3 酶学性质检测

对分离自结核样品的110株菌进行多种酶学性质和生物活性(QQ和QS)的检测，结果表明几乎所有菌株均具有过氧化氢酶活性，有较高比例的细菌具有酯酶(吐温20、40)活性，而具有β-半乳糖苷酶和酯酶(吐温80)活性的细菌所占的比例最少(见表3)。通过K板检测，共发现24株细菌具有锰氧化能力(见表4)，并且锰氧化菌株分布于不同的分离样品中，对研究锰结核的形成机制提供了丰富的菌种资源。

2.4 系统进化树的构建

东太平洋结核区可培养细菌系统进化树见图5、6为γ-变形菌纲可培养细菌系统进化树，图7为α-变形菌纲可培养细菌系统进化树。由构建的系统进化树可见，锰氧化细菌均属于变形菌门，主要分布于α-变形菌纲的交替单胞菌目和假单胞菌目以及γ-变形菌纲的红杆菌目。

3 讨论

通过培养方法和非培养方法研究细菌的生态功能和群落结构是相互补充的，非培养方法能够获得未培养细菌的序列信息，而使用培养方法可以获得菌种资源，进而研究菌株的生理功能、系统进化关系和生态作用。目前对东太平洋结核区微生物群落结构的研究多采用非培养的研究方法[5-8,22]，本研究为了尽可能多的获得该区域的菌株资源并分析其多样性，在分离过程中采用了3个温度梯度，并使用了不同的培养基，其中2216E为富营养培养基，R2A和SPG-4为寡营养培养基，K板为锰氧化菌株筛选培养基。采用 R2A和SPG-4共分离得到细菌119株，50种；K板分离得到35株，14种；2216E分离得到248株，103种；除2216E外的3种培养基所分离的菌株中发现有32种未在2216E平板中分离得到。因此相比以单种常用培养基(如2216E)对可培养细菌进行分离培养，采用多种培养基能分离出更多的菌种资源。

结核区所有样品所分离获得的菌株中，γ-变形菌纲的细菌数量最多，占所有分离菌株的49.75%，其次是α-变形菌纲，占所有分离菌株的31.34%。该结果与张海艳等[23]使用培养方法分离东太平洋结核区沉积物样品的结果类似，占最高比例的类群也为γ-变形菌纲细菌。属水平上，假单胞菌属，交替单胞菌属，赤杆菌属，副球菌属，亚硫酸盐杆菌，盐单胞菌属，海杆菌属[24]等优势属均曾经报道过具有锰氧化能力，并且其中部分菌种参与锰结核的形成。种水平上，庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌在所分离菌株中所占比例最高，通过实验验证其具有锰氧化能力，并且该菌种具有氧化亚硫酸盐的能力[25]，因此其很可能参与该地区的锰氧化和硫循环。同时，麦氏交替单胞菌和南海沉积物赤杆菌所占的比例也较高，并且其均具有锰氧化能力。

Xu等[5]以培养和非培养的方法研究结核区微生物多样性时，使用培养方法仅获得了6个属的细菌，然而我们采用不同培养基分离出65个属的细菌，其中盐单胞菌为可培养细菌的优势类群，与Xu等[5]的研究结果相一致。盐单胞菌属具有较强的盐耐受性，并有较强的环境适应能力，在有氧条件下，能以氧气作为电子受体，而无氧条件下部分菌株则以硝酸盐作为电子受体。彭亚林等[26]通过实验证实了一株盐单胞菌有很强的锰耐受和锰氧化能力，因此推测盐单胞菌能够参与结核区的有机物和金属离子的循环。除盐单胞菌外，假单胞菌属在本研究中也占有较大的比例，与Xu等[6]使用非培养方法的结果类似。假单胞菌属在海洋中分布极为广泛，代谢类型多样，能够形成生物被膜并利用多种有机物作为碳源和电子供体。来自不同地区的许多假单胞菌均具有锰氧化能力，其中对恶臭假单胞菌GB-1[27](Pseudomonasputida)锰氧化活性的研究最为透彻，因此其在锰循环中应发挥一定的作用。

对4种不同样品所分离菌株的群落组成进行比较分析，结果表明结核覆盖的沉积物样品的可培养细菌多样性比结核样品高。 Wu等[8]通过16S rRNA基因克隆文库技术对结核样品和无结核覆盖的沉积物样品进行了研究，结果发现沉积物中所含的物种数比结核中的多，Tully等[28]对南太平洋环流区的结核样品进行高通量测序后也发现结核覆盖沉积物的细菌多样性比结核内部高。由此可见，通过培养方法获得的不同样品细菌多样性与非培养方法结果类似，而推测其原因是由于沉积物中潜在的物质能量来源支持了更多微生物的生存，除此之外，结核内部较高的金属离子浓度也可能抑制某些敏感细菌的生长。

4种不同的样品类型均能够分离得到锰氧化菌，表明东太平洋多金属结核区锰氧化菌分布广泛。分离获得的24株锰氧化菌中，抑云玫瑰变色菌(Roseovariusnubinhibens)、星箭头菌(Sagittulastellata)和南极中山菌(Zhongshaniaantarctica)首次发现具有锰氧化活性，而其他菌株所在的种属均已有报道具有锰氧化能力[29]，对东太平洋结核区更深入的研究可能发现更多具有锰氧化活性的菌株。由锰氧化细菌形成的锰结核能富集周围环境中的其他微量元素，包括钴、铜、镍和锰等，因此其在微量元素的循环中也起到重要作用[9]。此外，锰结核能够裂解周围腐殖质产生的低分子量有机物，从而促进该地区微生物的生长和物质循环[30]。对结核样品进行酶学活性检测发现，具有锰氧化活性的游海假交替单胞菌和产黑假交替单胞菌具有检测的所有酶学活性，进一步印证了假交替单胞菌代谢底物的广泛性。相对于沉积物样品，Wu等[8]在沉积物与结核的群落结构比较中发现有且仅有在结核样品存在的菌株中，假交替单胞菌和交替单胞菌丰度较高，因此该属菌株在结核的形成中很可能发挥重要作用。在实验中共检测出13株细菌具有QS活性，QS能够影响生物被膜的形成[31]，而Wang等[1]认为生物被膜与结核的形成有关，从而这些具有QS活性的菌株也可能在结核的形成过程中发挥一定的作用。

由构建的系统进化树可见，γ-变形菌纲可分为6个分类单元，其中南极中山菌(Zhongshania antarctica)独立形成1个分类单元，与其他菌株的进化距离较远。在α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)中，共有5个分类单元，其中红螺菌目(Rhodospirillales)独立形成一个分类单元，与其他菌株的进化距离较远，从系统进化树中也可以看出不同类群的菌株中均含有锰氧化细菌。

本实验较为详细地对东太平洋多金属结核区不同样品进行了细菌的分离培养，表明东太平洋结核区拥有丰富的微生物资源；对结核样品分离出的菌株进行了酶学性质的检测，对理解结核区微生物的基础代谢类型奠定了基础；具有锰氧化能力菌株的鉴定及活性检测有助于了解结核的形成过程。然而至今为止，结核形成的具体原因还是未知的，需要继续探索来解开这个谜团。

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责任编辑 高 蓓

Diversity of Culturable Bacteria in the East Pacific Nodule Province

CHENG Jing-Guang, YU Min, DAI Xiao-Feng, ZHANG Zeng-Hu, LIU Na,AN Ke, SHI Xiao-Chong, ZHANG Xiao-Hua

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The east Pacific nodule province, which is considered as one of the most commercially important nodule areas of the global ocean, is located in the northeast Pacific Ocean. There are plenty of polymetallic nodules on the seabed. The mechanism of formation of manganese nodules is still unclear, but a growing amount of evidences show that nodules can not be formed without bacteria. To investigate the diversity of culturable bacteria in the east pacific nodule province, four kinds of samples were collected during the cruise “DA YANG 29”, including nodule samples, sediment samples overlaying nodules on its surface, sedment samples without overlaying nodules on its surface and bottom seawater samples. A totol of 1 200 bacterial strains were isolated and conserved, and 402 strains were identified using 16S rRNA gene sequencing, which were composed of 4 bacterial phyla, 65 genera and 135 species. The results turned out that the microbial resources in this place were abundant and showed a great diversity. The 4 phyla included Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes, accounting for 81.59%, 8.21%, 8.21% and 1.99% of the totol culturable bacterial community, respectively. Only bacterial strains belonged toα-Proteobacteriaandγ-Proteobacteriawere isolated in this study. In Genus level,Halomonas,PseudomonasandSulfitobacterwere dominant, while the dominant species includedSulfitobacterpontiacus,Halomonasmeridiana,Alteromonasmacleodii,Paracoccuscarotinifaciensetc. The proportion of Actinobacteria and Firmicutes were higher from sediment samples than that of the other two kinds of samples, while the pencentage ofα-proteobacteriawas higher from nodule samples. Isolates from γ-proteobacteria was abundant in all the four kinds of samples. In addition, the enzymatic properties of isolates from the nodule sample were studied. The proportions of bacteria containing catalase or lipase (hydrolysis of Tween20 or Tween40) were high, in contrast, bacteria containing β-galactosidase or lipase (hydrolysis of Tween 80) had a lower proportion. Some unreported manganese oxidizing bacteria were also isolated from different samples, includingRoseovariusnubinhibens,Sagittulastellata,Psychrobacteraquaticus,Zhongshaniaantarctica, other manganese oxidizing bacteria have only been reported in the genus level. All the isolates which had manganese oxidizing activity belonged to Proteobacteria, in the neighbour-joining phylogenetic tree using 16S rRNA gene sequences. In brief, the culturable bacteria were abundant from different samples of the nodule province, the isolation and identification of manganese oxidizing bacteria have significant roles to study the mechanism of polymetallic nodule’s formation and the exploitation of marine minerals.

the east Pacific nodule province; culturable bacteria; enzymatic properties; manganese oxidizing bacteria; 16S rRNA gene

中国大洋协会项目(DY125-15-R-03)资助 Supported by China Ocean Mineral Resources R & D Association

2016-07-22；

2016-11-07

程景广(1990-), 男,硕士生, 主要从事海洋微生物研究。 E-mail: chengjingguang1102@qq.com

❋❋ 通讯作者：E-mail: yumin@ouc.edu.cn

Q938.8

A

1672-5174(2017)06-042-11

10.16441/j.cnki.hdxb.20160247

程景广，于敏，戴晓风，等. 东太平洋结核区可培养细菌的多样性研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(6): 42-52.

CHENG Jing-Guang, YU Min, DAI Xiao-Feng, et al. Diversity of culturable bacteria in the east Pacific nodule province [J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6): 42-52.