滨海河口区黑藻的耐盐碱性及氮磷净化效果❋

李杨杨， 陈友媛,2**， 孙 萍， 陈广琳(. 中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 26600； 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 26600)

滨海河口区黑藻的耐盐碱性及氮磷净化效果❋

李杨杨1， 陈友媛1,2**， 孙 萍1， 陈广琳1
(1. 中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100； 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100)

滨海河口区水体盐碱含量高，生态景观萧条，亟需筛选既能耐盐碱又能有效去除氮磷的植物。采用实验室水培实验，分析黑藻(Hydrillaverticillata)在盐碱混合胁迫下的生长状况、生理响应以及对盐碱水体中氮磷去除效果。结果表明：黑藻在pH =7、pH= 8和pH =9胁迫下，能耐受的最高盐度分别为9、6和3。在其耐盐碱范围内，植株长势良好，含水率与对照组相比降幅在5%以内，酶活性稳定，在盐度小于6刺激下叶绿素含量略有升高；在其盐碱耐受范围外，黑藻细胞膜透性变大，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性下降，渗透物质调节能力差，脯氨酸与Na+含量最高可达对照组的4.67和9.13倍，此时黑藻生长受阻，对氮、磷的净化效果较差。

黑藻；盐碱混合胁迫；生理响应；氮磷净化；滨海河口区

青岛市李村河下游河道受到海水的潮汐、往复运动的影响，导致该地区的水体盐度及pH过高。高盐碱度使许多植物受到渗透伤害和离子毒害，产生生理干旱，从而长势变差，最终死亡甚至消亡[1]，致使滨海地区景观萧条。

盐碱会对植物产生渗透胁迫、氧化胁迫、离子毒害，造成植物营养亏缺、破坏物质-能量平衡[2]，使不耐盐碱植物的生长受到抑制，降低了植物去除氮磷的能力。植物的成活率、相对生长速率、含水量可直观地反映植物耐盐碱性强弱[3]；叶绿素含量、膜渗透性、酶活性等生理指标能更准确的表征植物耐盐碱程度[4]。而盐碱胁迫产生的大量活性氧(ROS)导致细胞膜脂过氧化作用加剧，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性显著降低。而在盐碱胁迫下，有些植物可通过脯氨酸、甘露糖醇，果聚糖，海藻糖等有机小分子的合成以及Na+、K+、Cl-等无机离子的积累调节渗透平衡[5]，提高植物的盐碱适应能力，进一步增加植物对盐碱环境中氮、磷等营养盐的吸收。

植物由于可同化吸收营养盐而被广泛应用于生态浮岛以修复地表水体和污水[6]。目前国内外的关于耐盐碱植物的研究主要集中在碱蓬[7]、羊草[8]、碱地肤[9]等耐盐性较好的盐生植物以及苎麻[10]、水稻[11]、燕麦[12]等具有经济价值的作物，黑藻繁殖能力强，生长速度快，对盐碱的耐受性较好，且有一定的摄取营养盐的能力，是一种理想的净化污水沉水植物[13]。研究表明，黑藻对水体中氨氮和磷具有较高的去除率，经过黑藻的净化，水体中磷和氮的浓度达到规定标准而且显著地提高了水体中溶解氧水平，说明黑藻具有明显改善水质的特性[14-15]。

本研究选用滨海地区较为常见的黑藻(Hydrillaverticillata)为研究对象，针对其最敏感的幼苗期，通过测量黑藻生长、生理指标以及分析其对水体中氮磷的去除效率，探讨了 (1)黑藻在盐碱胁迫下生长状况和耐盐碱性；(2)盐碱胁迫下黑藻的细胞膜脂过氧化反应和渗透调节作用；(3)黑藻对盐碱水体中氮磷的净化效果。皆在为滨海高盐碱水体的污染防治提供一种优选物种，同时对我国河口退化的生态系统的恢复与重建提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验植物

黑藻：俗称温丝草，是水鳖科、黑藻属单子叶多年生沉水植物，茎细长直立、叶带呈披针形，叶缘较小为锯齿形，无叶柄喜生于湖泊，池塘等淡水水体[16]。黑藻由于其具有生存范围广，生长繁殖快[17]，富集营养盐能力强以及有效维持水下生态系统结构的稳定[14]等优点而被广泛用于治理富营养化的污水[18]。

本实验黑藻采自江苏省并用塑料袋运回实验室。试验前将黑藻幼苗用蒸馏水反复冲洗干净，并将幼苗水培半个月，使其能够适应无土环境，温度为(20 ± 4)℃，自然光照。

1.2 试验方案

1.2.1 试验设计 采用盐度和pH值混合交互胁迫的方式进行全面实验。其中，采用优级纯NaCl来调整蒸馏水的盐度到0、3、6、9、12、15；NaHCO3与Na2CO3按照0:0、1:0、10:1的比例调整水体pH依次为7、8、9(由于用碱性盐NaHCO3与Na2CO3调节水体pH值，故本文将pH胁迫简称为碱胁迫)。每个盐碱交互胁迫组设3个重复。其中，pH为7实验组定义为单独盐胁迫组；pH为8、pH为9实验组定义为盐碱混合胁迫组；盐度为0，pH为7的实验组为对照组，并设无植物的空白对照。实验水质及盐碱梯度(见表1)参考李村河下游监测断面的实测水质，水体中其余营养元素参考Hoagland营养液[19]配置。

Note：①Experiment water quality；②Water quality of the licun river

1.2.2 实验方法 选取长势一致、分枝相同的黑藻幼苗，用蒸馏水反复冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，移植到实验容器中(高20 cm，直径10 cm的塑料量杯，内盛1 L实验用水)，保持每个实验组幼苗种植密度为(5±0.1) g·L-1。为避免植株的盐激效应，采用每天递增3盐度、0.5 pH的方式对植株进行驯化，逐步增加实验水体中盐度与pH，直到达到设定值为止。实验期间，每日用蒸馏水补充蒸发的水分。在胁迫前后，选取植株相同位置测量各生长、生理指标。

1.2.3 检测项目和方法 植物生长及生理指标：鲜重含水率采用烘干称重法测定[20]；相对电导率采用浸泡法测定[20]；叶绿素含量采用乙醇提取法测定[21]；丙二醛含量采用三氯乙酸提取分光光度法测定[22]；SOD活性采用氮蓝四唑光化还原法[23]；POD活性采用愈创木酚法测定[23]；CAT活性采用分光光度法测定[23]。脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法测定[20]；可溶糖含量采用蒽酮比色法测定[20]；甜菜碱含量采用雷氏盐比色法测定[24]；无机离子K+、Na+、Cl-含量采用离子色谱法[26]。

水质指标：氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定[26]；硝氮采用紫外分光光度计法测定[26]；总氮采用紫外分光光度法测定[26]；总磷采用钼酸铵分光光度法测定[26]。

仪器采用TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析，中国)，ICS-3000离子色谱仪(戴安，中国)。

1.2.4 计算公式 鲜重含水率的计算公式见(1)：

W=(FW-DW)/FW×100%。

(1)

式中：W表示鲜重含水率，单位为%；Fw指植物鲜重，单位为g；Dw指植物干重，单位为g。

平均相对生长速率(RGR)计算公式见(2)：

RGR=(lnW2-lnW1)/(t2-t1)。

(2)

式中：RGR表示每天每克植物的生长量，单位为mg·(g·d)-1；W1指初始时刻t1植物的干重，单位为mg；W2指终止时刻t2植物的干重，单位为mg。

对营养盐的去除效率计算公式见(3)：

E=(C1-C2)×V/FW/(t2-t1)。

(3)

式中：E表示植物对营养盐的去除效率，单位 mg·(g·d)-1；C1指初始时刻t1的营养盐含量，单位mg·L-1；C2指终止时刻t2的营养盐含量，单位mg·L-1；V指实验水体体积，单位 L；Fw指植物鲜重，单位 g。

1.2.5 数据处理 实验数据用Origin 9.0进行绘图，SPSS 22.0软件进行统计分析。显著性水平设置为P<0.05。在图表中±后数值表示3个平行之间的标准偏差，数据后不同字母表示在P<0.05水平上有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 盐碱胁迫下黑藻的生长状况

盐碱胁迫下黑藻的RGR见表2。在单独盐胁迫中，盐度为0、3、6时，黑藻的RGR无显著变化，最高降幅为5.48%；在盐碱混合胁迫中，盐度分别为6、pH=8和盐度为6、pH=9时，黑藻的RGR显著下降(P<0.05)，降幅分别为对照组的24.96%、38.08%。混合盐碱胁迫下RGR明显低于单一盐胁迫实验组。说明较高的pH值对植物细胞造成了较大的伤害，限制了黑藻的生长。

盐碱胁迫下黑藻的含水率见表2。黑藻含水率均随着盐度的升高呈下降趋势。盐胁迫中，盐度为0、3、6、9时，黑藻的含水率变化不显著；pH为8、pH为9胁迫下，盐度分别为6、3时，黑藻含水率显著下降(P<0.05)，降幅分别为对照组的3.18%、5.17%。盐度较高(12～15)时，植株出现烂根现象，与对照组相比，含水率最高降幅可分别达38.71%。盐碱共同作用下，植物细胞质pH较高，离子流进流出较快使得植物细胞失水，从而含水率下降。

2.2 盐碱胁迫下黑藻的生理响应

盐胁迫和碱胁迫对植物造成的伤害首先表现在细胞膜透性方面，相对电导率、丙二醛含量越高表示其受到的伤害越大，细胞膜透性越差；叶绿素作为主要的光合色素，其含量能够较为直观地反映植物在盐碱胁迫下的生长情况；SOD、POD、CAT可有效清除活性氧，保护细胞结构的完整性与细胞膜的功能性；脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱、无机离子等渗透调节物质的积累与合成是植物体抵抗渗透胁迫、避免离子毒害的有效方式之一。因此可通过测定上述生理指标并结合植物生长状况，确定黑藻的耐盐碱能力。

2.2.1 相对电导率和叶绿素 黑藻在盐碱胁迫下相对电导率的规律见图1(a)。单独盐胁迫下，当盐度达到12时，黑藻的相对电导开始显著上升(P<0.05)，而盐碱混合胁迫下黑藻的相对电导率的增速明显高于单一盐胁迫实验组，当盐度为9、pH=8和盐度为6、pH=9时，相对电导率显著升高(P<0.05)，分别为对照组的2.12、2.01倍，此时植物生长状况较为良好。

盐碱胁迫下黑藻组织内叶绿素含量的变化见图1(b)。在单独盐胁迫和pH=8胁迫下，盐度6以内对叶绿素的合成具有促进作用；pH=8 和pH=9盐碱胁迫下，盐度分别为9、6、6时，叶绿素含量显著降低(P<0.05)，与对照组相比最高降幅在40%以内，此时植物的生长可维持正常状态；随着盐度的继续升高，植物出现萎黄现象。盐碱混合胁迫光合作用抑制程度较大，不利于黑藻的生长。

2.2.2 丙二醛与酶活性 黑藻在盐碱胁迫下的丙二醛变化规律见图2(a)所示。单独盐胁迫下，盐度为0、3、6时，黑藻组织中的丙二醛含量变化不显著，细胞发生缓慢氧化反应，在盐度为9时，丙二醛含量显著升高(P<0.05)；盐碱混合胁迫下，盐度分别为6、pH=8和盐度为6、pH=9时，黑藻相对电导率显著升高(P<0.05)，分别为对照组的1.63、2.03倍，随着盐度的升高，丙二醛含量迅速增加，黑藻受到较为严重的伤害，取样时发现植物根际腐烂，植物发黄，说明该盐碱梯度已超出了植物所能耐受的范围。

2.2.3 渗透调节物质

2.2.3.1 有机溶质 盐碱胁迫对黑藻组织内脯氨酸含量的影响见图3(a)。pH=9盐碱混合胁迫时黑藻脯氨酸含量明显高于盐胁迫和pH=8盐碱混合胁迫的实验组含量，盐度达到15时，黑藻幼苗脯氨酸含量最高，为对照组的5.59倍。研究表明，脯氨酸具有清除细胞活性氧、减轻细胞膜脂过氧化、调节高渗透势的功能[30]，此时植株叶片枯黄脱落，伴随烂根现象出现，植物细胞受到伤害较为严重，需要分泌大量脯氨酸来进行渗透调节。

黑藻可溶糖含量在盐碱胁迫下的变化规律见图3(b)。盐胁迫、pH=8和pH=9盐碱混合胁迫下，当盐度分别为6、3、3时，可溶糖含量出现最高值，分别为对照组的5.21、3.69、4.26倍，此时植物生长状况良好；当盐度升高时，可溶糖含量开始显著下降(P<0.05)，此时可溶糖作为糖原而被大量消耗，植物开始出现萎黄现象；随着盐度的继续升高，可溶性糖不能调节植株体内的渗透压，结合黑藻枯萎、发黄等特征可以说明植物的生长受到伤害。

盐碱胁迫下黑藻组织内甜菜碱的含量变化规律见图3(c)。盐胁迫、pH=8和pH=9盐碱混合胁迫下，盐度分别达到9、9、6时，黑藻组织中甜菜碱含量显著升高(P<0.05)，最高分别为对照组的1.27、1.26和1.37倍，植物可以通过提升甜菜碱醛脱氢酶的活性，增加细胞质中甜菜碱的积累，平衡细胞内渗透势，从而提高对盐碱胁迫的适应性。

2.2.3.2 无机离子 在盐碱胁迫下，植物根际水势降低，因此需要吸收一定的盐离子来维持细胞渗透平衡。无机离子是较为廉价的渗透调节溶剂，与有机溶剂的合成相比，无机离子的积累需要较少的能量[13,31]。

盐碱胁迫下黑藻植株中Na+含量如图4(a)所示。盐胁迫、 pH=8和pH=9盐碱混合胁迫下，盐度分别为9、6、3时，黑藻植物组织中Na+含量增幅较低，与对照组相比最高增幅均低于110%；此后，随着盐度的升高，Na+含量快速升高，最高可达对照组的5.56倍；盐度的升高以及含水率降低导致的细胞脱水是造成植株Na+含量升高的主要因素。

盐碱胁迫下黑藻植株中K+含量如图4(b)所示。盐胁迫、pH=8盐碱混合胁迫时，盐度分别为6、3时，与对照组相比黑藻K+含量降幅均在30%以内；pH=9、盐度高于9的条件对黑藻植株吸收K+有较大的阻碍作用，说明黑藻在逆境条件下可大量吸收K+来维持细胞的稳定。

盐碱胁迫下黑藻植株中Cl-含量如图4(c)所示。盐胁迫、pH=8和pH=9盐碱混合胁迫下，当盐度分别达到9、9、6时，植物组织Cl-含量显著升高(P<0.05)，与对照组相比最高增幅分别可达31.07%。盐碱胁迫对植株进行Cl-吸收有较大的影响。

盐碱胁迫下黑藻植株中Na+/K+如图4(d)所示。盐胁迫、pH=8和pH=9盐碱混合胁迫下，当盐度分别达到9、9、6时，植株组织中Na+/K+显著升高(P<0.05)，分别为对照组2.35、7.82、6.85倍。随着盐度的升高，pH=9胁迫下的黑藻植株组织Na+/K+均明显高于盐胁迫。植物组织中Na+和K+存在竞争机制，为维持液泡中的离子平衡，Na+/H+转运蛋白的主动运输可将Na+隔离到液泡中[32-33]，此时植物通常选择性吸收Na+、Cl-抑制K+，致使Na+/K+显著升高(P<0.05)，进一步造成离子毒害[33-34]。

2.3 盐碱胁迫下黑藻对氮、磷去除效果

2.3.1 对氨氮、硝氮、总氮的去除效果 黑藻对盐碱水体中氮磷的净化作用取决于其对盐碱的耐受能力。盐碱胁迫下黑藻对氨氮、硝氮、总氮的去除效率见图5(a)、5(b)、5(c)所示。当盐度分别为9、6、3，黑藻对3种形态氮去除效率开始显著下降(P<0.05)；之后随着盐度的继续升高，黑藻对3种形态氮的去除效率迅速降低，此时植株腐烂，向水体中释放大量的氮素，使得此时水体中氮含量可能高于初始值[35]，黑藻除了消耗部分能量用来抵抗盐碱胁迫之外，已经没有足够的能量去除水体中的氮，导致黑藻对氮的去除效率急剧下降。

3 结论

(1)在pH=7、pH=8和pH=9时，黑藻能耐受的最高盐度分别9、6、3。高盐碱胁迫下，RGR和含水率显著降低(P<0.05)，盐碱交互胁迫加大了对黑藻的伤害，出现萎黄、烂根现象，植物生长受到抑制。

(2)在盐碱耐受范围内，脯氨酸等有机溶质的合成与无机离子的积累可维持细胞渗透平衡，酶促反应良好；盐碱耐受范围外，相对电导率和丙二醛含量增加，细胞膜透性增大，质膜受到伤害，Na+、Cl-流入、K+流出，SOD、POD、CAT活性均显著降低(P<0.05)，植物生长受到较大的阻碍。

(3)黑藻在其盐碱耐受范围内对含盐碱水体中的总氮、总磷具有较好的去除效果，最高可分别达0.083 和0.028 mg·(g·d)-1；当盐度与pH升高，植物维持自身正常生理活动所需要的能量较大，黑藻对氮、磷的去除效果较差。总体上，黑藻是一种净化高盐碱水体的优选植物。

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责任编辑 庞 旻

The Salt-Alkali Tolerance and Nutrient (N, P) Removal Performance ofHydrillaverticillatain Coastal Estuary Area

LI Yang-Yang1, CHEN You-Yuan1,2, SUN Ping1, CHEN Guang-Lin1

(1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China； 2. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China).

The high salt-alkali content in coastal estuary resulted in the landscape depression. Screening plants which not only tolerate salt-alkali stress but also effectively remove nitrogen and phosphorus was in need. In this study, seedlings ofHydrillaverticillatawere treated under salt-alkali stress by hydroponic culture. The growth, physiological response and removal efficiency of nitrogen and phosphorus byHydrillaverticillatawere measured. The results showed the limits ofHydrillaverticillata’ salt tolerance were less than 9, 6 and 3, while the corresponding pH values of the water were 7, 8 and 9, respectively. Within the limits, the differences of water content of plants between salt-alkali treated groups and controlled group (without salt or pH stress) were less than 5%. Chlorophyll content was increased slightly at low salinities (<6). Beyond the limits, membrane permeability increased with increasing salinity and pH value. Enzyme activity was reduced sharply. Meanwhile, proline ofHydrillaverticillataand the concentrations of Na+were as 4.67, 9.13 times high as control group in response to salt-alkali stresses. As a result, the growth ofHydrillaverticillatawas inhibited and the removal efficiency for nitrogen and phosphorus reduced significantly.

Hydrillaverticillataseedlings; interactive salt-alkali stress; physiological response; nitrogen and phosphorus purification; coastal estuary region

青岛市科技攻关项目(12-4-1-58-HY);青岛市政府采购项目(T-20150205-018)资助 Supported by Qingdao Science and Technology Research Projects(12-4-1-58-HY); Qingdao Government Procurement Projects (T-20150205-018)

2016-04-21；

2016-05-24

李杨杨(1991-)，女，硕士生，现从事水资源保护与水污染控制研究。E-mail：776078523@qq.com

❋❋ 通讯作者：E-mail：youyuan@ouc.edu.cn

X522

A

1672-5174(2017)06-034-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160140

李杨杨，陈友媛，孙萍,等.滨海河口区黑藻的耐盐碱性及氮磷净化效果[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2017, 47(6): 34-41.

LI Yang-Yang,CHEN You-Yuan,SUN Ping, et al.The salt-alkali tolerance and nutrient (N, P) removal performance ofHydrillaverticillatain coastal estuary area[J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6): 34-41.