外源NO供体SNP对盐胁迫下苜蓿叶片POD活性的影响

李易兴

（兰州市渔业技术推广中心，甘肃 兰州 730000）

外源NO供体SNP对盐胁迫下苜蓿叶片POD活性的影响

李易兴

（兰州市渔业技术推广中心，甘肃 兰州 730000）

试验通过对盐胁迫下苜蓿幼苗叶片分别喷施不同浓度的一氧化氮（NO）供体SNP，研究了SNP对100mmol/L NaCl胁迫下苜蓿幼苗叶片POD活性的影响。结果表明，0.5mmol/L和1.0mmol/LSNP能提高在长时间100mmol/L NaCl胁迫下苜蓿幼苗叶片POD活性，其通过减轻细胞膜脂过氧化程度，维持质膜结构稳定性，从而减小损伤程度，对损伤具有较好的缓解作用；0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的SNP对POD活性影响不明显，无明显缓解效果。说明SNP对POD活性的调节和植物的保护作用与SNP自身浓度相关，同时，SNP不仅可以通过调节POD活性增强苜蓿抗氧化能力，而且能通过调节其他保护酶类起到对苜蓿的保护作用，缓解盐胁迫造成的伤害。

SNP；盐胁迫；苜蓿叶片；POD

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科牧草，在我国的农业结构调整中，大力发展饲料植物应首推苜蓿。因其具有营养价值高，适口性好，适应性广等特点，是家畜的优良饲草，也是良好的水土保持植物，在我国农业生产中具有举足轻重的地位。但因环境条件的影响，苜蓿在生长期内备受盐碱土壤的胁迫，我国大面积的盐碱地使苜蓿产业化面临着如何利用盐碱土资源合理开发的问题。因此，选择耐盐碱的苜蓿品种进行土地改良，创造经济效益的同时又兼顾生态效益和社会效益，最终产生出适应性好的苜蓿品种成为苜蓿产业化发展的必要保证。通过对苜蓿盐害或耐盐机理的研究，利用化学调控手段是提高苜蓿耐盐性的有效措施之一。

植物遭受逆境胁迫伤害的重要特征之一是活性氧代谢失调，根据McCord和Fridovich（1969）提出的生物自由基伤害学说，在盐渍、干旱等逆境条件下，植物体内自由基增加，导致脂类发生过氧化，破坏膜系统的结构和功能，使植物细胞不能维持其高度有序的结构而受伤死亡[1]。植物在长期的抗逆过程中形成了自身的保护系统，其中，广泛存在于植物体中的过氧化物酶POD是活性较高的一种酶，它能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。同时，过氧化物酶POD作为内源保护系统中的保护酶，是植物内源自由基消除剂，它通过增强或保持自身较高水平的酶活性，使逆境中的植物减轻自由基伤害[2]。

据研究，一氧化氮（NO）是近几十年来发现的一种新的植物生长调节物质，可使植物的抗逆性有所增强。其对植物具有双重性作用——保护细胞或毒害细胞，当NO处于较低浓度时对植物细胞具保护作用，当浓度较高时可能造成对细胞的毒害[3]。

本试验通过测定在盐胁迫下外源一氧化氮供体（SNP）对苜蓿幼苗叶片POD活性影响，分析不同浓度SNP与植物POD活性的关系，旨在为进一步提高苜蓿的耐盐性、选育优良品系和饲草生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为紫花苜蓿。

1.2 方法

1.2.1 土壤灭菌、播种及移栽育苗 将育苗所用土壤拌入有机肥料于高压灭菌锅25℃灭菌2h，将苜蓿种子均匀地播撒入灭菌后的土壤，用塑料薄膜覆盖保湿，并置于自然光下培养。期间及时浇水，保持土壤湿度。待生长出子叶后，揭去薄膜于自然光下培养。在长出3～4片真叶时移栽入花盆，于自然光下培养育苗，适时浇水。

1.2.2 供试材料处理 移栽苜蓿幼苗后，待植株生长至8～9幼小叶片，选取生长较一致的植株即可进行处理。首先用不同浓度NO供体硝普钠50 mL进行叶面喷施，36 h后分别用100 mL含100 mmol/L的NaCl进行盐胁迫处理，同时在溶液中加入不同浓度NO供体硝普钠，连续处理3d。设6种试验处理：CK，用蒸馏水喷施；N，100 mmol/LNaCl胁迫处理；0.1s，含100mmol/LNaCl和0.1 mmol/LSNP溶液；0.2s，含100mmol/LNaCl和0.2mmol /L SNP溶液；0.5 s，含100 mmol/L NaCl和0.5 mmol/L SNP溶液；1.0s，含100 mmol/LNaCl和1.0 mmol/LSNP溶液。每种处理设3个重复。处理1d、2d、3d以及恢复生长第3天分别取样进行POD酶活性测定。

1.2.3 过氧化物酶POD的测定

1.2.3.1 测定原理 过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验是以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在该酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该红棕色的物质在波长470 nm处有最大光吸收，故可通过测470 nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶POD的活性。

1.2.3.2 实验主要仪器 研钵；100 mL烧杯；冷冻离心机；电子天平；电热恒温水浴锅；分光光度计等。

1.2.3.3 实验主要试剂 50 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；愈创木酚；30%H2O2；50 mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液。

1.2.3.4 测定方法

提取酶液：称取苜蓿幼苗叶片0.25 g，于预冷的研钵中，并加入预冷3 mL的50 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英沙研磨成匀浆，转入离心管，再用2 mL上述磷酸缓冲液冲洗研钵转入离心管于4℃下10 000 r/min离心15 min，离心所得上清液即为POD粗提液。

配制反应液：取100 mL pH6.0的磷酸缓冲液，加入56 μL愈创木酚，加热溶解后冷却，再加入38 μL 30%H2O2，混合均匀保存于冰箱中备用。

POD测定：取光程为1 cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3 mL，50 mmol/L磷酸缓冲液1 mL作为调零管。另一只加入反应液3 mL，提取的粗酶液1 mL，立即开始计时，在470 nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔半分钟记录一次吸光度值，共测2 min。测定结果按以下公式计算POD活性。

过氧化物酶活性=（△A470*VT）*（0.01FW*Vs*t）-1，其中：

A470——反应时段内吸光值的变化；FW——样品鲜重（g）；VT——提取酶液总体积（mL）；Vs——测定时取用酶液体积（mL）；每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫前SNP对POD活性的影响

图1 NaCi处理前SNP对苜蓿幼叶片POD活性的影响

由图1可以看出，对照CK为仅用蒸馏水处理的植株，其表现正常生长下苜蓿叶片的POD活性，它显著低于4种SNP处理（P＜0.01），所有SNP处理中0.1 s处理的POD活性显著高于其他SNP处理（P＜0.01），0.2 s、0.5 s、1.0 s处理依次降低。说明与对照相比，在正常生长条件下，4种浓度的SNP单独处理可以显著提高苜蓿POD活性（P＜0.01），其中以0.1 mmol/L SNP对酶活性的提高效果最好，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/LSNP对POD活性的影响都显著低于0.1 mmol/LSNP（P＜0.01）。

图2 盐胁迫对苜蓿幼苗叶片POD活性的影响

2.2 盐胁迫对POD酶活性的影响

由图2可以看出，在进行NaCl胁迫初期（0～24 h）POD活性显著升高，随着胁迫的持续，胁迫时间的增长，48 h后POD活性下降极显著（P＜0.01），较24 h测定时下降92.4%，72 h后测定酶活性较48 h升高3倍多（336.6%），但仍显著低于24 h测定值（P＜0.01）。与CK相比，N处理的POD活性始终显著高于同时段的CK（P＜0.01）。由此可知，POD活性在胁迫初升高是因为植物自身的保护系统通过提高内源保护酶活性来抵抗外界环境胁迫，而长时间的盐胁迫使植物细胞过度损伤，膜系统无法继续维持其稳定性，但可能由于苜蓿本身具有耐盐特性，加之幼苗期植株生长较快，能够缓解100 mmol/L NaCl胁迫，在胁迫72 h时体现出POD活性的上升。

2.3 SNP对苜蓿幼苗盐胁迫下POD活性的影响

图3是6种试验处理的苜蓿幼苗叶片的POD活性测定值图示，其中图3-A示不同浓度SNP+100 mmol/LNaCl处理苜蓿24 h时的测定值，从图中可知，N处理显著高于CK和4种SNP处理（P＜0.01），SNP处理中0.2 s显著高于0.1 s、0.5 s、1.0 s处理，但都显著低于CK（P＜0.01），说明苜蓿具有的自身抗盐性使其在100 mmol/L NaCl胁迫下能通过提高内源保护酶POD活性增强抗氧化能力，缓解胁迫伤害。4种浓度的SNP处理其POD活性低于单独盐胁迫处理可能是因为：苜蓿叶片在浓度为100 mmol/L盐胁迫下，POD不是SNP缓解胁迫的主要作用目标，所以SNP对POD活性影响不太明显，它可以通过调节其他保护酶的活性抵抗此浓度的盐胁迫，本试验室也证实，SNP可提高100 mmol/LNaCl胁迫下的苜蓿叶片CAT活性，而对SOD活性影响不明显。

图3-B示不同浓度SNP+100mmol/L NaCl处理苜蓿48h时的POD测定值，可以看出，N处理和SNP处理显著高于CK（P＜0.01），SNP处理中0.5s显著高于其他，1.0s次之，二者都显著高于0.1s和0.2s（P＜0.01），但所有处理整体低于24h时测定值，说明SNP+NaCl处理48h时与对照相比，POD活性有所提高，SNP已经对盐胁迫下的苜蓿产生了一定保护作用，以0.5 mmol/L效果最好，1.0mmol/L次之。但因为盐胁迫时间较长，植物内源保护酶POD的抗氧化能力不再增强，不能继续维持膜系统的稳定性，细胞损伤较重。

图3 NaCl+SNP分别处理24 h、48 h、72 h时与CK和N处理间苜蓿幼苗叶片POD活性的比较

图3-C示不同浓度SNP+100 mmol/LNaCl处理苜蓿72h时的POD测定值，其中N处理POD活性显著高于CK（P＜0.01）和4种SNP处理（P＜0.01），0.5 s、1.0 s仍处于SNP处理中的最高水平，显著高于0.1s和0.2s。由N处理可知苜蓿自身的抗盐性使胁迫处理后期POD活性仍能保持在高于CK的水平。同时，0.5mmol/L和1.0 mmol/L SNP对长时间100 mmol/L盐胁迫下的苜蓿POD活性提高较0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的低浓度SNP效果好，说明0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP能够较好缓解长时间100 mmol/L NaCl对苜蓿幼苗叶片的膜损伤。

2.4 恢复生长后POD的活性变化

由图4可以看出，4种SNP处理显著高于CK，0.5 s、1.0 s和N处理无极显著差异（P＜0.01），均高于0.1 s和0.2 s处理（P＜0.01），可知在恢复生长3 d后，单独盐胁迫处理的苜蓿因为自身较强的抗盐性POD仍能保持较高活性，恢复较好。0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP由于具有缓解100 mmol/L NaCl胁迫的作用，所以在恢复生长后仍能使POD活性保持在较高水平，这也是SNP对植物细胞起保护作用的主要原因之一。

图4 恢复生长后POD活性

3 讨论

植物盐胁迫损伤是植物遭受逆境胁迫伤害中较常见的一种。盐胁迫可导致植物自身活性氧代谢失调，最终使植物因细胞过渡损伤而死亡。但植物内源保护系统可在一定程度上缓解盐胁迫造成的伤害。在逆境胁迫下植物体可调动保护系统中的酶类，如POD，用以抵御和消除活性氧，以维持膜系统的稳定性。而NO作为一种活性氮，参与植物生长发育和对环境适应的信号转导过程，对植物也具有保护作用，但NO的保护作用与其有效生理浓度有关。

本试验通过设计不同浓度梯度的SNP对盐胁迫下的苜蓿幼苗叶片的处理，探讨NO对叶片POD酶活性的影响。试验中随着胁迫时间的增长，SNP逐渐体现出对POD活性的调节作用，试验证实0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP对苜蓿幼苗叶片在长时间100 mmol/L NaCl胁迫下产生的损伤具有较好的缓解作用，能提高POD活性，减轻细胞膜脂过氧化程度，从而减小损伤程度，对苜蓿抗盐胁迫能力具有辅助作用。由试验测定结果可以得出以下结论：苜蓿生长在具高盐碱土质的区域，长期的逆境胁迫，加之自然选择的作用使苜蓿具有较强的耐盐性，能通过提高内源保护系统中的保护酶活性维持膜系统的稳定性，抵抗外界环境的伤害。

从目前的研究来看，有关植物NO的研究大部分均试图探讨植物是否具有与动物类似的机制，尤其是在植物生长发育、抗病抗逆以及信号转达等方面。这种类比研究的方法为揭示植物NO的功能和作用机理提供了简便的途径，也是未来植物NO研究所采用的主要方法和思路之一。

[1]王学征,韩文灏,于广建.盐分胁迫对番茄幼苗生理生化指标影响的研究[J].北方园艺,2004,（3）：48-49．

[2]梁艳荣,胡晓红,张颖力,等.植物过氧化物酶生理功能研究进展[J].内蒙古农业大学学报（自然科学版）,2003,2（26）：124-132．

[3]牟冬生.一氧化氮的研究进展[J].湖北民族学院学报（医学版）,2001,18（1）：40-43．

（编辑：高真贞）

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1006-799X(2016)21-0100-03

李易兴（1984-），女，甘肃兰州人，助理工程师，主要从事渔业技术推广工作。