医院环境物体表面及医务人员手分离病原菌对抗菌药物和消毒剂的耐药性

王会平，张洪江，董 歧，刘 洁，段 杉，葛军旗，王仲华，张 政

(北京市朝阳区疾病预防控制中心，北京 100021)



医院环境物体表面及医务人员手分离病原菌对抗菌药物和消毒剂的耐药性

王会平，张洪江，董 歧，刘 洁，段 杉，葛军旗，王仲华，张 政

(北京市朝阳区疾病预防控制中心，北京 100021)

目的 了解医院环境物体表面及医务人员手分离的病原菌种类，及其对医院常用抗菌药物和消毒剂的耐药性。方法对北京市某城区16所医院重症监护病房、普通病房环境物体表面和医务人员手分离的病原菌进行细菌鉴定及药敏试验、消毒剂抗性试验，并检测病原菌对抗菌药物和消毒剂耐药的基因携带情况。结果16所医院环境物体表面和医务人员手共采集标本979份，检出病原菌75株(7.66%)，以革兰阴性(G-)杆菌为主(占78.67%)，其中铜绿假单胞菌(24株)、阴沟肠杆菌(14株)和肺炎克雷伯菌(4株)居前3位。有1株铜绿假单胞菌对氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星和左氧氟沙星耐药；1株阴沟肠杆菌对哌拉西林耐药，7株对呋喃妥因耐药；4株肺炎克雷伯菌对哌拉西林全耐药，2株对头孢类抗菌药物耐药，1株对美罗培南耐药。铜绿假单胞菌有7个耐药基因阳性，以mir阳性率最高(100.00%)；阴沟肠杆菌有4个耐药基因阳性，tem1和shv阳性率均为100.00%；肺炎克雷伯菌有5个耐药基因阳性，shv和mir阳性率均为100.00%。铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌对葡萄糖酸氯己定(耐药率分别为4.17%、57.14%)和三氯异氰尿酸(均为50.00%)均产生耐药，两种菌消毒剂耐药基因(qacE△1-sul1)阳性率分别为79.17%、57.14%；肺炎克雷伯菌对两种消毒剂均无耐药性，均未检出耐药基因。结论医院环境物体表面和医务人员手均存在多种引起医院感染的常见病原菌，以G-杆菌为主，且病原菌均出现不同程度的对抗菌药物和消毒剂耐药。

物体表面； 医务人员； 手； 病原菌； 抗菌药物； 消毒剂； 耐药

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：921-925]

近年来，临床标本分离的病原菌对抗菌药物和消毒剂的耐药性已经引起人们的广泛关注[1-4]，但对医院环境表面分离的病原菌耐药状况研究较少[5]。研究[6-7]表明，医院环境物体表面携带较多病原菌，甚至在消毒后仍存在许多病原菌，病原菌很容易附着于医务人员手上，进而传播给患者，若为耐药菌株，患者感染后会给临床治疗带来较大的困难，同时也给患者带来巨大的经济损失[8-10]。为了解医院环境物体表面和医务人员手病原菌的分布情况，及其对医院常用抗菌药物和消毒剂的耐药性，我们进行了相关研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 标本主要来源于北京市某城区16所医院(二级医院6所、三级医院10所)重症监护病房(intensive care unit,ICU)、普通病房环境物体表面、医务人员手分离的病原菌。标准菌株为铜绿假单胞菌ATCC 15442、大肠埃希菌ATCC 13706和肺炎克雷伯菌ATCC 27336(美国Microbiologics公司)，标准菌株主要用于抗菌药物药敏试验、消毒剂抗性实验及基因检测的质量控制。

1.2 标本采集 依据GB15982-2012《医院消毒卫生标准》规定的方法，对医院ICU、普通病房进行环境物体表面和医务人员手标本的采集。环境物体表面和医务人员手进行日常清洁后，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子涂抹采样，然后将采样棉拭子头置于10 mL无菌生理盐水试管内。

1.3 病原菌分离、鉴定和药敏试验 采集的标本按常规培养方法进行细菌分离培养后，采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统(VITEK 2 Compact，法国生物梅埃公司)进行病原菌种类鉴定及药敏试验。药敏试验采用AST-GN09药敏卡测定革兰阴性(G-)菌对21种常用抗菌药物的耐药性。

1.4 消毒剂抗性试验 试验选择的消毒剂为医院常用于皮肤消毒的胍类消毒剂葡萄糖酸氯己定(4.6 g/L)和常用于环境物体表面消毒的含氯消毒剂三氯异氰尿酸(1.5 g/片)。经中和剂鉴定试验确定葡萄糖酸氯己定的中和剂为含1%组氨酸的DE中和肉汤，三氯异氰尿酸的中和剂为含0.5%硫代硫酸钠的磷酸盐溶液。用液体培养基稀释法[11]测定消毒剂对病原菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)。具体操作方法：使用接种环从新鲜的固体营养琼脂培养基(培养18～24 h)上挑取4～5个克隆转移至5 mL MH肉汤内培养4～6 h，浓度达0.5麦氏单位，取0.01 mL菌液加入0.1 mL对倍稀释的消毒剂和0.1 mL双倍浓度的MH肉汤，同时设阴性和阳性对照。经过37℃培养48 h后观察结果。无菌生长的消毒剂最低浓度为MIC，从MIC开始向上2个浓度，各吸取0.1 mL混合液接种至0.9 mL相应中和剂中作用10 min，然后再吸取0.5 mL混合液接种至营养琼脂培养基，经过37 ℃培养48 h后无菌落生长的浓度为MBC，该试验重复3次。以标准菌株的MIC作为判断标准，MIC大于标准菌株的试验菌即存在消毒剂抗性。

1.5 耐药基因检测 采用聚合酶链反应(PCR)扩增方法对病原菌耐药基因进行检测，PCR扩增产物经测序后进行比对证实为目的基因，PCR扩增产物的基因测序由北京吉美生物技术有限公司完成。病原菌DNA提取的操作步骤参照QIAamp DNA Mini Kit说明书(QIAGEN公司)进行，DNA模板液置于-20℃冰箱备用。PCR扩增靶基因的名称、引物序列及产物长度见表1。PCR扩增热循环参数为：96℃预变性5 min，96℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环，72℃延伸8 min。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，经溴乙锭染色，通过紫外成像仪观察结果。

表1 PCR引物序列及产物长度

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料以百分率描述，组间比较以卡方检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原菌检出情况 采集16所医院环境物体表面(床单位、诊疗器械等)和医务人员手标本979份，检出病原菌75株，检出率为7.66%。检出的病原菌以G-杆菌为主(占78.67%)，其中铜绿假单胞菌(24株)、阴沟肠杆菌(14株)和肺炎克雷伯菌(4株)居前3位，革兰阳性球菌以凝固酶阴性萄萄球菌(6株)、肠球菌(4株)为主。二级医院和三级医院病原菌检出率比较，差异无统计学意义(χ2=2.99，P>0.05)。ICU环境物体表面和医务人员手病原菌检出率低于普通病房(χ2=13.38，P<0.01)。见表2。环境物体表面共采集标本868份，其中床单位、诊疗器械表面和其他物体表面病原菌检出率分别为8.13%、2.91%、9.54%；医务人员手共采集标本111份，护士和其他医务人员手病原菌检出率分别为3.85%、21.21%。见表3。

表2 不同级别医院及病房病原菌检出率比较

表3 医院不同标本病原菌检出率比较

Table 3 Comparison in detection rates of pathogens from different hospital specimens

标本标本数病原菌株数检出率(%)床单位455378.13诊疗器械17252.91其他物体表面241239.54护士手7833.85其他医务人员手33721.21合计979757.66

2.2 耐药性分析

2.2.1 药敏结果 24株铜绿假单胞菌中有1株对氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星和左氧氟沙星耐药，该菌株来源于ICU的枕芯表面；14株阴沟肠杆菌中，有1株对哌拉西林耐药，7株对呋喃妥因耐药；4株肺炎克雷伯菌对哌拉西林全耐药，有2株对头孢类抗菌药物耐药，1株对美罗培南耐药，该菌株来源于ICU的听诊器。

2.2.2 耐药基因检测 分别检测3种G-杆菌中磺胺类、β-内酰胺类和氨基苷类耐药基因的携带情况,其中铜绿假单胞菌有7个耐药基因阳性，以mir阳性率最高(100.00%)，其次tem-1、sul1和sul2阳性率均>50%；阴沟肠杆菌有4个耐药基因阳性，其中tem1和shv阳性率均为100.00%，mir和dha阳性率分别为92.86%和42.86%；肺炎克雷伯菌有5个耐药基因阳性，其中shv和mir阳性率均为100.00%，sul1、sul2和dha阳性率均为50.00%。见表4。

2.3 消毒剂耐药性分析

2.3.1 MIC和MBC测定结果 对葡葡萄糖酸氯己定的耐药性结果显示，24株铜绿假单胞菌的MIC为8～32 mg/L，MBC为 16～64 mg/L，其中1株产生耐药性(4.17%)；14株阴沟肠杆菌的MIC为8～32 mg/L，MBC为32～64 mg/L，其中8株产生耐药性(57.14%)。对三氯异氰尿酸的耐药性结果显示，24株铜绿假单胞菌的MIC为64～256 mg/L，MBC为128～512 mg/L，12株产生耐药性(50.00%)，其中11株菌株来源于环境物体表面；14株阴沟肠杆菌的MIC为64～128 mg/L，MBC为256～512 mg/L，其中7株产生耐药性(50.00%)，均来源于环境物体表面。铜绿假单胞菌对三氯异氰尿酸的耐药性高于葡萄糖酸氯己定(P<0.01)，肺炎克雷伯菌对两种消毒剂均无耐药性。见表5。

2.3.2 耐药基因检测 检测3种G-杆菌消毒剂耐药基因(qacE△1-sul1)，结果显示24株铜绿假单胞菌中，19株(79.17%)检出耐药基因；14株阴沟肠杆菌中，8株(57.14%)检出耐药基因；4株肺炎克雷伯菌均未检出耐药基因。

表4 16所医院分离的主要G-杆菌抗菌药物耐药基因携带情况[阳性菌株数(%)]

Table 4 Carriage of antimicrobial resistance genes in main gram-negative bacilli from 16 hospitals (No.of positive isolates[%])

抗菌药物基因名称铜绿假单胞菌(n=24)阴沟肠杆菌(n=14)肺炎克雷伯菌(n=4)磺胺类sul116(66.67)0(0.00)2(50.00)sul213(54.17)0(0.00)2(50.00)β-内酰胺类tem-120(83.33)14(100.00)0(0.00)shv5(20.83)14(100.00)4(100.00)dha0(0.00)6(42.86)2(50.00)vim7(29.17)0(0.00)0(0.00)mir24(100.00)13(92.86)4(100.00)氨基苷类aph(3’)-I1(4.17)0(0.00)0(0.00)

表5 不同G-菌对两种消毒剂的MIC和MBC

3 讨论

本组诊疗器械表面病原菌检出率为2.91%，低于床单位和其他物体表面，提示病房环境中床单位和其他公共用品的消毒工作需引起医务工作者的重视。护士手标本病原菌检出率为3.85%，低于其他人员，说明医院应该加强护士以外的其他医务人员如护工、保洁人员等的手卫生。ICU病原菌检出率(4.61%)低于普通病房(10.83%)，可能与ICU患者病情危重、机体抵抗力低，且经常进行各种侵入性诊疗，其医务人员医院感染相关理论知识掌握较好及管理能力较强，更重视对ICU环境的消毒工作有关。此外，对ICU出入人员进行严格控制，也可有效预防和控制医院感染。

研究[12-14]结果表明，铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌已成为ICU呼吸道和泌尿系统医院感染的常见致病菌。本研究分离的75株病原菌主要以G-杆菌为主(占78.67%)，其中铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌居前3位。药敏试验结果显示，24株铜绿假单胞菌PCR扩增实验检测mir阳性率100.00%，tem-1阳性率为83.33%，其他3种基因阳性率相对较低,提示mir和tem-1基因在铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素(如青霉素类、头孢菌素类)产生耐药的过程中发挥着重要作用[15]。另外，1株铜绿假单胞菌对氨基苷类和喹诺酮类抗菌药物耐药，同时发现该菌株sul1、sul2和aph(3’)-I基因均阳性，说明该菌通过携带aph(3’)-I型氨基苷类修饰酶基因对氨基苷类药物产生耐药[16]。肺炎克雷伯菌的药敏结果与大多数铜绿假单胞菌相似，其中4株肺炎克雷伯菌对哌拉西林均耐药，部分菌株对硝基呋喃妥因和复方磺胺甲口恶唑均耐药，shv和mir阳性率均为100.00%，表明肺炎克雷伯菌主要是通过获得编码β-内酰胺酶的shv和mir基因对β-内酰胺类抗生素产生耐药[17]。其中1株肺炎克雷伯菌除对以上抗菌药物均耐药外，对美罗培南也耐药，该菌株来源于ICU的听诊器。诊疗器械直接接触患者，一旦有多重耐药菌定植，传染给患者的概率较大，将给临床治疗和医院感染控制带来很大困难。

葡萄糖酸氯己定和三氯异氰尿酸为医院常用于皮肤黏膜和物体表面消毒的常用消毒剂，MIC和MBC结果表明，铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌对葡萄糖酸氯己定和三氯异氰尿酸均产生耐药，且阴沟肠杆菌对葡萄糖酸氯己定的耐药性高于铜绿假单胞菌；而肺炎克雷伯菌对两种消毒剂均敏感。临床工作人员可依据病原菌选择合适的消毒剂进行消毒。3种病原菌消毒剂耐药基因qacE△1-sul1检测结果发现，铜绿假单胞菌耐药基因阳性率为79.17%，阴沟肠杆菌耐药基因阳性率为57.14%，病原菌可以通过携带qacE△1-sul1基因对消毒剂产生耐药[18]。

医院的消毒工作在医院感染控制中占重要地位，而医院环境致病菌的控制主要通过使用消毒剂达到消毒或灭菌效果。随着多种消毒剂的广泛使用，消毒剂耐药菌株也随之产生，给医院日常消毒工作带来较大困难。当病原菌同时出现消毒剂抗性和抗菌药物耐药性时，医院感染控制工作形势将更为严峻。因此，医院要重视消毒剂在医院环境物体表面和医务人员手消毒过程中的规范使用，建立专门的消毒管理部门，加强科学使用消毒产品的管理和培训。使用消毒剂时，参考消毒产品说明书使用剂量和使用范围，同时根据医院的实际情况，对医院环境的清洁消毒等级进行分类，制定标准化操作流程。通过及时了解细菌对消毒剂敏感性的变化，有针对性地调整消毒产品的有效使用浓度，必要时可以更换消毒产品种类。只有科学、合理、有效地使用消毒产品才能确保消毒效果，从而切断传播途径，有效预防和控制医院感染。

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(本文编辑：孟秀娟)

Antimicrobial and disinfectant resistance of pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of health care workers

WANGHui-ping,ZHANGHong-jiang,DONGQi,LIUJie,DUANShan,GEJun-qi,WANGzhong-hua,ZHANGZheng

(BeijingChaoyangDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100021,China)

Objective To investigate the types, antimicrobial resistance, and disinfectant resistance of pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of health care workers (HCWs).Methods Pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of HCWs in intensive care units and general wards in 16 hospitals in Beijing were performed bacterial identification, antimicrobial susceptibility testing, and disinfectant resistance testing. The carriage of antimicrobial resistance genes and disinfectant genes in pathogens were also detected.Results A total of 979 specimens were collected from inanimate surfaces and hands of HCWs in 16 hospitals, 75(7.66%)pathogenic strains were isolated, 78.67% of which were gram-negative bacilli. The top 3 pathogens werePseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa,n=24),Enterobactercloacae(E.cloacae,n=14), andKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae,n=4). OneP.aeruginosastrain was resistant to aztreonam, gentamycin, tobramycin, ciprofloxacin, and levofloxacin; OneE.cloacaestrain was resistant to piperacillin, 7 strains were resistant to nitrofurantoin; 4K.pneumoniaestrains were all resistant to piperacillin, 2 were resistant to cephalosporins, and 1 was resistant meropenem.P.aeruginosahad 7 drug-resistant genes, positive rate ofmirwas 100.00%;E.cloacaehad 4 drug-resistant genes, positive rates oftem1andshvwere both 100.00%;K.pneumoniaehad 5 drug-resistant genes, positive rates ofshvandmirwere both 100.00%. The resistant rates ofP.aeruginosaandE.cloacaeto chlorhexidine gluconate were 4.17% and 57.14% respectively, to trichloroisocyanuric acid were both 50.00%, positive rates of drug-resistant genes (qacE△1-sul1)were 79.17% and 57.14% respectively；K.pneumoniaehad no resistance to two kinds of disinfectant, dug-resistance gene was not found.Conclusion Multiple common pathogens which can cause healthcare-associated infection exist in hospital environmental inanimate surfaces and hands of HCWs, which are dominated by gram-negative bacilli, pathogens had resistance to antimicrobial agents and disinfectant in different degrees.

inanimate surface; health care worker; hand; pathogen; antimicrobial agent; disinfectant; drug resistance

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.006

2016-02-16

首都卫生发展科研专项(2011-7023-03)

王会平(1979-)，女(汉族)，河北省石家庄市人，主管检验师，主要从事医院感染管理研究。

张政 E-mail：anggie_zhzh@126.com

R181.3+2

A

1671-9638(2016)12-0921-05