EML4-ALK 融合基因重排对晚期非小细胞肺癌诊断及治疗价值*

姚文秀， 李秀娟， 黄欢

610041成都 四川省肿瘤医院·研究所,四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 胸部肿瘤内科(姚文秀)； 610500 成都成都医学院(李秀娟); 530000 南宁 广西医科大学(黄欢)

•综述•

EML4-ALK融合基因重排对晚期非小细胞肺癌诊断及治疗价值*

姚文秀△， 李秀娟， 黄欢

610041成都 四川省肿瘤医院·研究所,四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 胸部肿瘤内科(姚文秀)； 610500 成都成都医学院(李秀娟); 530000 南宁 广西医科大学(黄欢)

肺癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤之首，而非小细胞肺癌占所有肺癌的80%以上，研究显示EGFR及ALK是非小细胞肺癌的主要驱动基因，针对这两个靶点的靶向药物近年来取得了明显的疗效，受到了广泛关注，本文针对 EML4-ALK 融合基因重排阳性患者的相关研究进行综述。

非小细胞肺癌; EML4-ALK融合基因; 靶向治疗

近年来，全球肺癌的发病率和死亡率(包括男性及女性)均呈明显上升趋势，居于恶性肿瘤的首位[1]。中国近30年，肺癌的发病率上升迅速，随着空气污染加重、工业化进程的发展及分子检测技术的进步，未来10年中国肺癌的发病率可能还会进一步升高。据统计在所有的新诊断的肺癌患者中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 占比约80%～85%，15%～20%为小细胞肺癌。其中确诊时约50%～70%患者已出现局部或远处转移，属于局部晚期或晚期病人，失去了手术根治切除机会，全身化疗、分子靶向治疗、姑息放疗及最佳支持治疗是这部分患者主要的治疗手段。针对无驱动基因突变患者，以铂类(主要指第一代的顺铂和第二代的卡铂)为基础药物联合第三代抗肿瘤药物组成的两药联合化疗方案是晚期及局部晚期NSCLC的标准一线治疗方案，但化疗客观缓解率只有20%～30%，1年生存率仅33%左右，化疗期间很多患者会出现程度不同的不良反应，如：骨髓抑制、胃肠道反应、脱发等，从而严重影响患者治疗依从性[2]。因此医药工作者一直在寻求一种高效低毒的抗肿瘤治疗药物在提高患者生活质量的同时，进一步改善晚期肺癌患者的总生存情况。近年来，随着分子检测技术的进步及对肺癌发病机制了解的深入，分子靶向治疗已成为NSCLC 最主要及最具应用前景的治疗手段，得到了医药工作者及患者、家属的广泛关注。肺癌的发生、发展是多因素、多步骤参与的过程，驱动基因(EGFR、ALK、KRAS等等)在肺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 是目前研究最多、最透彻的驱动基因，并相继研发出许多针对该靶点的小分子络氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosinekinase,EGFR-TKIs)，如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼和大分子的单克隆抗体，如西妥昔单抗、尼妥珠单抗等，针对EGFR敏感突变患者一线采用EGFR-TKIs治疗与化疗相比较，客观缓解率(objective response rate,ORR)及中位疾病进展时间(progression free survival,PFS)均明显优于化疗[3-5]。继EGFR之后，研究发现了另一种新的NSCLC作用靶点，也是NSCLC的主要驱动基因-即棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule-associated protein like4,EML4)间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因，称EML4-ALK 重排融合基因[6]。该基因重排融合将导致酪氨酸激酶的异常活化和表达，从而引起细胞的增殖和转移。Soda等[7}[8-10]。针对EML4-ALK融合基因的第一代抑制剂—克唑替尼的临床研究结果显示：克唑替尼治疗ALK融合基因阳性患者具有非常显著的疗效。基于以上原因，本文将从EML4-ALK融合基因的结构特征、临床常用的检测方法及ALK抑制剂的临床研究进展、ALK抑制剂耐药后治疗策略方面综述如下：

1 EML4-ALK 融合基因的结构特征

Soda 等[7]于2007年从一名肺腺癌患者手术切除的标本中筛选出一个新型DNA片段，该基因片段可编码一个由1 059个氨基酸组成的蛋白质。这种新型编码蛋白质的氨基端与人类EML4编码蛋白的部分结构相同，而该编码蛋白质的羧基端则与人类ALK编码蛋白的部分结构相同。因此猜测该新型DNA片段有可能是由EML4基因和ALK基因融合重排形成的。进一步研究证实，该融合基因是由分别位于人类2号染色体的p21基因片段EML4和p23基因片段ALK倒位融合，重排为EML4-ALK 融合基因，引起酪氨酸激酶的异常表达，从而导致肿瘤发生及发展。EML4属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族[11]，其结构由N末端碱基区，疏水的棘皮动物微管相关蛋白区(hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein，HELP区)及WD重复区三部分构成[12]。其中，N末端碱基区在EML4-ALK融合蛋白生成中起重要作用，而靠近N端的卷曲螺旋域(coiled-coil domain，CC区)全部由EML4 的2号外显子编码，HELP区或WD重复区的缺失会使激酶的活性降低50%以上。近年来科学家们在肺癌细胞中发现了近20多种EML4-ALK融合基因的变异体[13]，其中最常见的是变异体1(ALK的20～29号外显子与EML4的1～13号外显子的融合)、变异体3a(LK的20～29号外显子与EML4的1～6a外显子的融合)及变异体3b(ALK的20～29号外显子与EML4的1～6b外显子的融合)。目前对EML4-ALK融合基因变异体的研究仍然在进行中。

2 EML4-ALK融合基因的检测方法

目前临床用于检测EML4-ALK 融合基因的方法主要包括三种，即: 免疫组织化学方法(immunohistochemistry，IHC) 、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和荧光原位杂交方法( fluorescence in situ hybridization，FISH) 。目前在NCCN指南、ESMO指南及专家共识中，FISH被认为是检测EML4-ALK 融合基因的“金标准”，但许多学者认为：RT-PCR和高通量IHC(Ventana IHC)检测方法也有优势，通过RT-PCR和Ventana IHC检测到EML4-ALK 融合基因均被认同，因此被广泛用于临床实践及研究中。

以上三种检测方法各有优缺点，其中FISH采用探针特异性标记细胞核中ALK 断裂点来检测重排的ALK，分离的荧光信号提示存在ALK重排[14]。该检测方法的优点是可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异，敏感性和特异性均相对较高，当免疫组化方法不能确定有无突变存在时可用此法进行确认。但FISH的结果也受到一些因素的影响，如标本固定时间长、烤片温度过高、蛋白消化不当、变性温度差异，都会使荧光信号减弱或无信号，并且它所观察到的信号不能区分不同的EML4-ALK 融合基因变异体，价格相对较昂贵。而RT-PCR 作为最早用于EML4-ALK 融合基因检测的方法，具有诊断快速、敏感性高的特点，应用范围广，可以同时检测多个已知亚型[15-16]。但RT-PCR检测方法对RNA的质量要求高，需要高纯度的mRNA，对于新鲜标本的检测的阳性率较高，但对于蜡块包埋的组织标本由于RNA大量降解而使其灵敏度降低，且RT-PCR技术对实验室要求高。常规IHC简便易行、价格便宜、操作方法成熟，是最常用的ALK融合基因筛查方法。早期的ALK融合蛋白的IHC抗体因敏感性较低(ALK1, Dako)，不适宜用于ALK融合基因的检测。随着技术的改进，新一代具有高度亲和力的D5F3(cell signaling,Beverly,Mass)和5A4(Abcam, Boston, Mass)抗体检测ALK融合蛋白的敏感性和特异性分别达到了100%和95%～99%[17]。但该方法同样不能分辨出具体的ALK 融合基因类型，而且由于肿瘤组织中ALK 蛋白的表达微弱和局限，其检测的敏感性相对RT-PCR和FISH要低[18]。当其对检测阳性不确定时，需用FISH来验证。2015年美国FDA批准罗氏公司开发的Ventana ALK(IHC D5F3)检测作为一种伴随诊断，识别非小细胞肺癌ALK阳性患者。Ventana IHC在全自动化仪器上操作，采用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶系统的染色信号放大技术，大大提高了ALK融合蛋白IHC检测的敏感性。除上述几种方法外,还有cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)-偶联PCR测序法，该方法采用含有逆转录的RACE结合PCR技术来富集扩增含有ALK的融合变体，其敏感度大大提高。该方法不仅可检测EML4与ALK的融合，并明确其变异体类型，而且也可以检测其它基因与ALK的融合，从而发现新的融合基因[19]。

综上所述，以上几种检测方法各具特点，那么到底采用哪一种检测方法更具优势？2014年的欧洲肺癌年会(ELCC) 公布了一项对比性研究[20]， 共纳人1 320例NSCLC患者，发现Ventana IHC与FISH的吻合率达到了85%，阳性一致率达到95%，阴性一致率83%。以前指南推荐ALK阳性诊断的金标准为FISH分离探针。目前专家共识认为FISH、PCR及Ventana IHC三种方法均可作为ALK阳性NSCLC可靠的诊断方法。其中任意一种方法检测阳性均可作为选择使用ALK抑制剂的依据。

3 ALK抑制剂的临床应用

EML4-ALK融合基因是NSCLC的重要驱动基因，近年来针对ALK融合基因的抑制剂被广泛关注与研究。Soda等[21]在前期的实验研究中发现，小分子的ALK抑制剂能显著抑制肺癌及恶性淋巴瘤细胞的生长。接下来的几年时间里，陆续发表了针对该靶点的抑制剂的研究报道[22-23]。

第一代的ALK抑制剂—克唑替尼(Crizotinib) 是全球第一个研发成功并应用于临床的口服ALK抑制剂，该药物的作用机制主要是选择性与ATP结合，抑制活化的ALK酪氨酸磷酸化，从而阻断其下游信号分子激活，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。Kwak等[24]于2009年首先报告了克唑替尼治疗晚期EML4-ALK阳性的NSCLC患者的疗效，总共入组19例患者，客观缓解率达到53%。之后，克唑替尼Ⅰ/Ⅱ期临床实验(即PROFILE 1001研究)结果发布,并发表在2010年的新英格兰杂志上[25]。该研究总共纳入82例EML4-ALK融合基因阳性的晚期NSCLC二线及二线以上患者，口服克唑替尼250mg，bid。研究结果显示：患者客观缓解率达到57%，疾病稳定率(stable disease，SD)达到33% 。8周疾病控制率(disease control rate，DCR)为89%，6月无疾病进展率约72%。2011年8月美国FDA批准克唑替尼用于局部晚期或转移性ALK阳性NSCLC的一线治疗。Camidge 等[26]于2012年更新了PROFILE 1001研究的数据，迄止到2011年6月，共纳入149例患者，其中有143 例患者可评价疗效，客观缓解率60.8%，中位缓解持续时间为49.1 周，中位PFS为9.7月。1年生存率74.8%。克唑替尼主要不良反应表现为视力障碍、恶心、呕吐、腹泻、浮肿、便秘及肝功能损害，程度大多为Ⅰ/Ⅱ级。

随后相继开展了针对ALK阳性二线及二线以上晚期NSCLC采用克唑替尼治疗的Ⅱ期(PROFILE 1005)、Ⅲ期(PROFILE 1007)随机临床研究。Riely 等[27]报道了PROFILE 1005的研究结果：ORR 60%,其中CR2%,PR58%,SD27%,中位缓解持续时间11个月，中位PFS为8.1个月。在2012 ESMO 大会上报告了PROFILE 1007研究的有效性、安全性和生活质量数据，结果显示：与标准二线化疗(培美曲塞或多西他赛)相比，克唑替尼治疗显著延长ALK阳性NSCLC患者的PFS并提高客观缓解(objective response rate,ORR)，克唑替尼与化疗相比较，ORR分别为65.3%vs.19.5%,P<0.0001;中位PFS分别为7.7月vs.3.0月，P<0.0001。PROFILE 1007临床数据确定了将克唑替尼作为晚期或局部晚期ALK阳性NSCLC患者的标准治疗[28]。在随机III期PROFILE 1014临床研究中，Solomon等[29]对比了克唑替尼与培美曲塞联合铂类方案化疗在一线治疗NSCLC患者中的疗效，入组343例ALK阳性晚期NSCLC,随机分为克唑替尼治疗组和一线标准化疗组(培美曲塞+顺铂或卡铂)，结果显示：两组患者中位PFS分别为10.9月vs.7.0月，P<0.0001；ORR分别为74%vs.45%，P<0.0001。2016世界肺癌大会(World Conferenceon Lung Cancer，WCLC)最新公布了PROFILE 1029试验中的结果。数据显示，与标准铂类化疗方案相比，克唑替尼治疗为患者的整体治疗带来明显获益，并改善患者的肺癌症状和整体生活质量。PROFILE 1029试验是一项克唑替尼治疗ALK阳性晚期NSCLC患者的随机、开放、双臂Ⅲ期临床研究，与之前的三期临床研究PROFILE 1014研究设计基本相同。区别在于PROFILE 1029的入组人群均为东亚人群，因而对东亚人群更具指导意义。研究显示，相较于标准含铂化疗，克唑替尼一线治疗对ALK阳性晚期NSCLC患者在无进展生存期和客观缓解率方面具有显著疗效(中位PFS11.1月vs.6.8月，P<0.0001;ORR 88%vs.46%,P<0.0001),且亚裔人群对克唑替尼的获益更多，表明对于ALK阳性晚期NSCLC亚裔患者，克唑替尼更是一线治疗的优选。

由于PROFILE 1014及PROFILE 1029两项针对ALK阳性晚期NSCLC一线治疗的结果均提示克唑替尼相较与化疗，可明显延长PFS，提高疾病缓解率，且安全，耐受性好，因此2012版NCCN指南推荐对于ALK阳性的晚期NSCLC患者一线治疗可选择克唑替尼。2013年中国FDA批准克唑替尼用于治疗ALK阳性的转移性或局部晚期NSCLC的患者。

4 ALK抑制剂耐药后治疗策略

克唑替尼与其他小分子络氨酸激酶抑制剂药物相似，针对ALK融合基因阳性患者疗效显著，遗憾的是大多数患者最终会产生耐药。研究[30-32]发现：克唑替尼获得耐药性的机制主要是激酶域的二次突变，占所有获得性耐药患者的22%-36%。并发现克唑替尼的二次突变具有耐药突变的多样性，包括L1196M看家基因突变、C1156Y、G1202R、S1206Y、G1269A突变和插入突变1151Tins。研究同时显示，在克唑替尼获得性耐药患者中发现了ALK融合基因的扩增。此外，研究还发现了克唑替尼获得性耐药的其他机制，如C-KIT,EGFR异常活化和KRAS突变。虽然明确了克唑替尼获得性耐药得多种机制，但仍然有部分患者的耐药机制不明确。

针对克唑替尼获得性耐药后续治疗可根据患者的不同情况采用不同的治疗策略。第一种治疗策略主要根据耐药患者不同的临床表现进行处理，分三种情况：第一种情况主要针对无症状的缓慢进展患者，可继续采用克唑替尼治疗。2014年《欧洲肿瘤学年鉴》杂志报道了194例采用克唑替尼治疗获得性耐药的ALK阳性晚期NSCLC患者，持续使用克唑替尼治疗的疗效，结果提示：继续克唑替尼治疗组患者的中位OS显著优于耐药后即中止克唑替尼治疗的患者(16.4月vs.3.9月，P<0.0001)。第二种情况针对出现有症状的全身多发转移而判定为爆发进展的患者则需要改变治疗方案，行为状态评分好的患者推荐采用含铂双药联合化疗±贝伐珠单抗。第三种情况对于判断为局部进展患者指南推荐在继续使用克唑替尼治疗的基础上给予局部治疗，如放疗、手术、射频消融等方法处理。

2014年4月美国FDA批准Ceritinib胶囊上市,用于经克唑替尼治疗进展或不耐受的患者,治疗ALK阳性的转移性NSCLC。2015年12月美国FDA批准Alectinib用于治疗晚期(转移性)ALK阳性NSCLC，适用于经克唑替尼治疗后恶化或不对其耐受的患者。2017年4月美国FDA批准Brigatinib上市，用于治疗对克唑替尼抵抗或不耐受的ALK阳性的NSCLC患者。对于克唑替尼继发性耐药患者，第二种策略就是换用更新一代的ALK抑制剂。目前第二(Ceritinib、Alectinib、Brigatinib)及第三代的ALK抑制剂(Lorlatinib)在治疗克唑替尼继发性耐药的患者取得了很好的疗效。研究结果显示[33-37]:Ceritinib、Alectinib、Brigatinib治疗克唑替尼耐药患者中位客观缓解率(ORR)分别为56%、50%、71%，中位PFS分别达到6.9月、8.9月和13.4月。在I期和II期研究结果中(研究编号：NCT01871805和NCT01801111)，Alectinib对中枢神经系统转移的NSCLC患者具有优异的治疗效果。为了进一步评价其疗效及安全性，研究者对这两项研究进行了汇总分析。两项研究均入组了既往接受过克唑替尼治疗、ALK阳性的NSCLC患者，所有患者均口服600毫克Alectinib，每天两次。共有136例患者基线存在CNS转移(占总研究人群60%)，其中50例患者基线CNS病灶可测量。95例患者(70%)既往接受过CNS放射治疗，其中55例患者在放疗结束6个月后开始Alectinib治疗。中位随访期为12.4个月(范围：0.9～19.7个月)。在基线具有可测量CNS病灶的患者中，CNS转移的客观缓解率为64%(95%置信区间(confidence interval，CI：49.2%～77.1%)，疾病控制率为90%，(95% CI：78.2%～96.7%)，中位缓解持续时间为10.8个月(95% CI：7.6～14.1个月)。在基线具有可测量CNS病灶和/或具有不可测量CNS病灶的患者中，CNS客观缓解率为42.6%(95% CI：34.2%～51.4%)，疾病控制率为85.3%(95% CI：78.2%～90.8%)，中位缓解持续时间为11.1个月(95% CI：10.3～不可评估)。在既往接受过和未接受过放疗的患者中，客观缓解率分别为35.8%(95% CI：26.2%～46.3%)和58.5%(95% CI：42.1%～73.7%)。该分析结果表明，Alectinib用于接受过克唑替尼治疗ALK阳性的NSCLC患者，不但全身治疗效果显著，对CNS转移也具有非常好的治疗效果。

目前第三代的ALK抑制剂Lorlatinib(劳拉替尼，PF-3922)的研究也取得可喜的结果[38]。对于ALK阳性晚期NSCLC患者一线克唑替尼治疗耐药后采用Lorlatinib 100mg,qd治疗,ORR46%,中位PFS13.5月，其主要三、四级不良反应为胆固醇、甘油三酯升高。基于Lorlatinib在I/II期临床研究中显示的疗效和安全性，2017年05月美国FDA已授予lorlatinib用于既往接受一种或多种ALK抑制剂治疗但病情进展的ALK阳性转移性NSCLC患者的突破性药物资格。一项III期临床研究CROWN(NCT03052608)已于近期开始招募患者，该研究是一项开放、随机、对照研究，在ALK阳性转移性NSCLC患者中开展，观察lorlatinib相对于克唑替尼用于一线治疗的疗效和安全性。

5 展 望

EGFR及EML4-ALK融合基因是NSCLC主要的两个驱动基因，两者在临床病理特征方面具有许多相似之处，如亚裔、女性、腺癌、少吸烟或不吸烟的NSCLC患者阳性检出率较高，相较于EGFR基因突变，EML4-ALK融合基因阳性患者更年轻，但两者同时检测为阳性的几率却很少。ALK抑制剂的成功研发及临床应用良好的疗效和安全性，给ALK融合基因阳性患者带来了明显的生存获益，中国食品药品监督管理局于2013年2月正式批准克唑替尼用于治疗晚期ALK阳性NSCLC患者。非常遗憾的是，ALK融合基因阳性患者使用克唑替尼治疗后中位1年左右大多数患者会产生获得性耐药。目前正在深入开展针对克唑替尼获得性耐药的机制研究，希望通过明确耐药机制采用不同的治疗策略，以进一步延长患者的生存期。第二、三代的ALK抑制剂相关研究已取得突破性进展，可望逐步应用于临床。作为医务工作者，我们希望这些新的药物能够为广大的晚期NSCLC患者带来更长的生存时间和更好的生活质量。

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TheProgressinDiagnosisandTreatmentofAdvancedNon-SmallCellLungCancerwithEML4-ALKFusionGeneRearrangementPositive*

Yao Wenxiu1△, Li Xiujuan2， Huang Huan3

(1.SichuanCancerHospital&Institute,SichuanCancerCenter,SchoolofMedicine,UniversityofElectronicScienceandTechnologyofChina,Chengdu610041,Sichuan,China;2.ChengduMedicalCollege,Chengdu610041,Sichuan,China;3.GuangxiMedicalUniversity,Nanning530000,Guangxi,China)

Lung cancer is most popular malignant tunors by both morbidity and mortality, non-small cell counts for 80%. Studies have shown that EGFR and ALK are the main driving genes for non-small cell lung cancer. In recent years, targeted drugs targeting these two targets have achieved remarkable curative effect and have been widely concerned. In this paper, we reviewed the related studies of EML4-ALK fusion gene rearranged positive patients.

Non-small cell lung cancer; EML4-ALK fusion gene; Targeted therapy

2017- 03- 29

2017- 08- 16

*四川省卫计委课题(编号：2012JY0058)

△姚文秀，E-mail: ywxhlx@sina.com

R734.2;R563

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.05.012

Yao WX, Li XJ， Huang H. The progress in diagnosis and treatment of advanced non-small cell lung cancer with EML4-ALK fusion gene rearrangement positive[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(5):390-395.[姚文秀，李秀娟，黄欢. EML4-ALK 融合基因重排对晚期非小细胞肺癌诊断及治疗价值[J].肿瘤预防与治疗，2017,30(5):390-395.]