α-地中海贫血无创产前诊断研究进展

王梓茗 综述 尹爱华 审校

（广州医科大学附属广东省妇儿医院 医学遗传中心，广东 广州 511442）

地中海贫血是一种常见的单基因遗传病，高发于热带、亚热带地区如东南亚、印度、地中海、中东、北非等地区及中国广西、广东、海南等省份。我国以α-地中海贫血最常见，α-地中海贫血的携带率高达7.88%［1］，其中--SEA则是占比最多的类型，-α3.7、-α4.2次之。--SEA是一条染色体上两个拷贝的α-珠蛋白基因均缺失DNA，因此无法合成α-珠蛋白，当--SEA纯合时，则无有效α-珠蛋白合成，胎儿在宫内即发生贫血，胎儿及胎盘高度水肿，即Bart水肿胎，最迟在出生后24小时内死亡。当夫妻双方均为--SEA携带者，则有25%的概率出现纯合型地贫胎儿。

目前认为最有效的预防措施主要是对高危孕妇进行产前诊断，并对重型地贫患儿进行选择性流产，从而有效避免重型地中海贫血患儿出生。传统的产前诊断方法为有创方法，即通过有创方法取样，直接检测胎盘或胎儿细胞中的遗传物质，是产前诊断中的金标准，但具有流产、胎儿损伤的风险。直到孕妇血浆中胎儿游离DNA的发现，使得无创、准确、简便、快速的产前诊断方法得以发展。本文主要综述无创产前诊断技术在α-地中海贫血方面的技术进展。

1 有创产前诊断方法现状

常用有创产前诊断方法主要包括：①绒毛活检术：时间是孕11～13＋6周，可用于早期诊断，缺点是胎儿丢失率相对较高（0.22%）；②羊膜腔穿刺术：在妊娠16周后进行，比绒毛活检安全（胎儿丢失率0.11%），缺点有损伤胎儿的风险；③胎儿脐静脉穿刺术：穿刺时间在孕24周后，缺点是对穿刺人员技术要求高，以及术中、术后胎儿并发症发生率高，包括短暂的胎儿心动过缓、脐带出血以及绒毛膜-羊膜炎等［2］。有创产前诊断方法目前广泛应用于核型分析、亲子鉴定及地中海贫血、耳聋等多种单基因遗传病的产前诊断中。

2 孕妇血浆中胎儿遗传物质的发现

1990年，Bianchi［3］首次阐述了母血中胎儿游离有核红细胞（fetal nucleated red blood cell，FNRBC）的存在，因其具有胎儿全套遗传物质，被认为是最理想的无创产前诊断工具。然而胎儿有核红细胞在孕妇外周血中有核红细胞的仅占30%～50%［4］，不仅需要的工作量大且易污染。同时，单个细胞中含有的遗传物质量少，不易检测多个位点。

1997年，Lo［5］首次从孕妇血浆中检测出男性胎儿Y染色体上特异序列，证实了胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的存在，使检测孕妇血浆中胎儿游离核酸为基础的无创产前诊断（noninvasive prenatal diagnosis，NIPD）成为现实。Lo［6］的研究还表明，胎儿游离DNA最早可在孕7周时检出，即理论上在孕早期就可进行检测，胎儿游离DNA含量随着孕周的增加而逐渐增加。胎儿游离DNA是同时期胎儿细胞成分的21倍，胎儿游离DNA具有重要的特征：①胎儿游离DNA明显短于孕妇来源的游离DNA［7］；②胎儿游离DNA的主要来源是进入母血中的胎盘滋养层细胞凋亡释放［8］；③胎儿游离DNA在母亲血浆中平均半衰期仅为16分钟［9］；④胎儿游离DNA在胎儿娩出后迅速被清除，在产后2小时后即从母血中消失，不易受既往妊娠影响；⑤胎儿游离DNA的含量与胎儿孕周、孕妇体重、先兆子痫等多种因素相关。相比于胎儿有核红细胞，胎儿游离DNA含量更加丰富［6］，且富集血浆游离DNA相对容易。

3 胎儿游离DNA的产前诊断研究现状

无创产前诊断最早应用于检测胎儿性别决定基因（SRY）及DYS14以排除X连锁遗传疾病，以及从RhD（－）的孕妇血浆中检测胎儿Rhesus D基因以获得胎儿处置的诊断依据［10，11］。时至目前，无创产前诊断已应用于多种单基因遗传病的排除性诊断，如囊性纤维病、软骨发育不全、亨廷顿病、先天性肾上腺皮质增生症等［12］。

第二代测序（next-generation sequencing，NGS）应用于非整倍体无创产前检测的理念最早于2008年提出［13］，目前该技术已应用于13、18、21号染色体的非整倍体无创产前诊断中，21-三体检出率达到99.3%，13-三体、18-三体检出率均达97.4%［14］。同时随着二代测序的平台的发展，已经通过全基因组测序的方法绘制出完整的胎儿游离DNA图谱，以及新算法的提出，例如基于NGS平台对于序列的绝对定量而提出的相对单体型剂量（relative haplotype dosage，RHDO）方法，可以借助单体型分析估算胎儿遗传的母源位点［8］，推动了无创产前诊断方法的进步。捕获序列测序方法较全基因组测序更有针对性，测序成本更低廉，目标区域测序更精准，逐渐取代全基因组测序成为新的发展方向。

4 α-地中海贫血无创产前诊断的方法进展

Chiu［15］在2002年首次报道了地中海贫血无创产前诊断应用，利用荧光定量PCR的方法，从孕妇血浆检测胎儿是否遗传父亲的β-地中海贫血致病基因，从而开启了地中海贫血无创产前诊断的道路。常用检测策略为排除法，即排除父源突变位点的方法，目前已有报道MALDI-TOF、单碱基引物延伸芯片、荧光定量PCR等多种方法在无创产前诊断方面的研究，且同样适用于β-地中海贫血以外的以点突变为主的多种单基因遗传病的。而常见的α-地中海贫血类型为缺失型，且缺失片段较大，其常用检测方法主要包括gap-PCR、多重荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等方法，而这些方法在高度片段化的cf DNA中检测大片段缺失存在困难。同时，Bart水肿胎发生在携带--SEA的母亲当中，则cf DNA背景中本身包含有1∶1比例的--SEA和野生型序列，排除法并不适用。目前研究的策略可以大体分为定量方法及多态位点分析方法。定量分析方法包括直接定量及相对剂量方法。相对突变含量方法是同时扩增含有对野生型或突变型基因的片段并分别定量，利用孕妇血浆中两种型别的序列是否存在不平衡而判断胎儿的基因型。而当胎儿为杂合时，突变型基因与野生型基因仍保持1∶1；当胎儿为突变型基因纯合时，突变型基因含量显著多于野生型。多态位点分析方法是利用致病基因紧密连锁的STR及SNP位点，从孕妇血浆中检测胎儿特异的STR或SNP位点，从而判断胎儿是否遗传来自父亲的野生型或突变型位点。该方法需要事先明确父母双方致病基因相关的SNP或STR位点，当双方均携带相同的SNP或STR时，该方法无法识别父源位点。

4.1 qPCR 和 QF-PCR Tungwiwat［16］使用巢式qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）的方法特异性扩增突变型（--SEA）基因，正常胎儿（αα／αα）突变型基因拷贝数为0，而Bart水肿胎中突变型基因则明显高于标准型和Hb H病，因此能够分辨Bart水肿胎的发生。Long［17］则以α1和α2基因之间的区域、无其他同源性的一段基因作为目的基因，以β-珠蛋白基因为参照，用 QF-PCR（quantitative fluorescence polymerase chain reaction）同时扩增内参（β-珠蛋白基因）和α-珠蛋白链上的目的基因，并使用毛细管电泳分析PCR产物峰面积比值改变以判断Bart水肿胎的发生。定量方法具有简便、分析简单、能够直接估计胎儿基因型的优点，但在极低的胎儿浓度下，real-time PCR尚无法区分目的基因和野生型基因的变化。

Ho［18］则利用--SEA断裂区内的两个微卫星位点16PTEL05和16PTEL06检测--SEA基因，--SEA基因并不存在这两个微卫星序列，通过检测父源特异的微卫星序列，即可判断胎儿是否遗传父亲的野生型基因，反之则遗传了父亲的--SEA基因，该方法能从混合样本中检测到仅2%的胎儿DNA，但2／3是由于胎儿遗传了父母相同的遗传标记或未能检出父源STR峰而不适用。Yan［19］则利用缺失区域内的9个SNP位点，在孕妇血浆中检测父源特异的SNP，并能够排除49.3%的父源性遗传--SEA导致的Bart＇s水肿胎。尽管如此，因为必须从大样本随机人群中筛选出候选多态性位点，并在携带者人群中筛选出合适的多态性位点，费时费力；还必须借助繁复的方法确定其单体型，但由于并非对胎儿致病基因的直接检测，需要提前获得父母双方的单体型，大大增加了检测周期及检测成本，难以推广；该方法有赖于足够数量的多态性位点才可做出准确诊断，而可用于从孕妇血浆中鉴别的遗传位点相当有限，相当比例的病例缺乏或仅有1个可供无创产前诊断检测的位点，不足以提供足够的信息分析，局限了对于致病基因的连锁分析的应用。

4.2 高通量测序 Ge［20］则使用目标序列捕获测序方法在检测胎儿致病性CNV的策略；而 Wang［21］则阐述了利用家系分析确定父母双方单体型，与孕妇血浆利用隐马尔科夫模型的Viterbi算法预测胎儿的单倍型和基因型，且相较于Ge的方法，由于目标区域长度短，且仅涉及少量高变异SNP位点，因此检测成本低。目标捕获序列针对性高，利用探针捕获所需研究的区域，可有效降低测序成本，而且对目标区域的测序深度更深，因此不仅能检测出SNP或点突变，也能有效识别出较大的缺失片段，如--SEA。然而，两种方法都对胎儿血浆浓度要求较高，在孕妇血浆中捕获的目标区域的特异性不如基因组中捕获［20］，目标区域的覆盖度易波动，因此在孕早期推行仍需要条件的优化；捕获探针需额外订制，因此订制的成本及周期较长。

4.3 数字PCR 数字PCR的反应体系与荧光定量PCR相似，但是通过稀释后将不同靶分子分布于单个反应室中，大部分反应室仅含不超过1个目标DNA分子，每个反应室单独进行PCR扩增，不同靶分子的分布符合泊松分布，通过对所有反应室中的阳性结果进行统计，可以做出目标分子的精确定量。早期需稀释加样到96孔板、384孔板或1536孔板，依赖繁琐的加样工作。微流式PCR芯片的出现，大大节省了加样工作，能将样品分布于芯片上预制的20 000个微孔中，但微流控芯片昂贵且通量有限，且易分散不均匀而影响分析。时至2011年，Bio--Rad公司的微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术推出，其原理是将样品分成大小均一的20 000个“油包水”微滴进行数字计数，生成的反应体系在直接96孔板上进行反应，最多可同时检测95个样品，最终利用双荧光通道检测，对扩增阳性油滴进行计数，且分散效果更稳定。传统荧光定量PCR依赖于标准曲线，需要额外的标准品，且易受扩增效率影响，而数字PCR用阳性结果数代替标准曲线，不仅减少了工作量和耗材，而且同时提供了定性和精确定量的结果，有利于数字化的分析。同时，单分子扩增的环境，使目标基因和参照基因可在独立的环境中扩增并独立统计，能同时对两个基因进行精确定量，进而基于目标基因拷贝数／参照基因拷贝数得出精确的拷贝数定量，而qPCR的模板含量改变间接推算拷贝数变化，并非直接拷贝数改变定量，且仅能分辨1.5～2倍的变化。由于独立的单分子扩增，极大程度上降低了与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，可从高度同源的背景中检测出低至0.001%的突变［22］，大大提高稀有基因的检测灵敏度。

Lun［23］的研究证实了数字PCR在目标分子拷贝数定量的优势，利用相对突变剂量（relative mutation dosage，RMD）和SPRT算法能识别出野生型和突变型基因含量的不平衡，从而预测胎儿在目标等位基因的基因型，是针对单基因病无创产前检测的重要策略。Pornprasert在数字PCR平台上分别定量，计算野生型、突变型基因的相对含量，能精确区分出Bart＇s水肿胎、标准型α-地中海贫血及正常人群，其结果也是符合预期，即在怀有Bart＇s水肿胎的孕妇血浆中，该比值为0，而怀有正常的胎儿的孕妇的比值相较于东南亚缺失型杂合的胎儿的比值显著升高。此外，数字PCR是高通量测序之外有力的CNV分析工具，且可以在原始样品上直接检测，不仅工作量小，检测周期短，也避免了高通量测序建库时引入的误差，以及测序深度、覆盖度对于分析精度的影响［22］，有文献报道，通过利用多重荧光数字PCR检测α-珠蛋白基因基因拷贝数来辨别常见的缺失型突变的方法［24］，对珠蛋白基因簇上多个位点进行定量。尽管如此，目前这些工作主要在外周血基因组DNA中分析，应用到无创产前诊断中仍然存在挑战。其中，在高度片段化的cffDNA中，高度同源的序列，尤其是假基因的存在，仍会给引物的设计带来困难，对拷贝数定量带来干扰。

5 展望

无创产前诊断是直接获取孕妇血浆中胎儿游离DNA进行检测的手段，相较于有创方法更安全、样本获得更方便、无并发症、早期诊断、快速等优点，是产期诊断中的重要研究方向，以实现胎儿的早期检测、及早干预，避免患病胎儿出生。而地中海贫血作为中国南方最主要的单基因遗传病，其无创产前诊断的实施具有重大意义。现时的技术难题包括：①cff DNA浓度低，尤其是孕早期，有赖于高灵敏的检测方法；②排除法诊断仅能避免50%的介入诊断手段；③cf DNA是高度片段化的，富集、检测仍存在挑战。而数字PCR平台能够在复杂的孕妇血浆DNA背景中检测出微量的胎儿基因，可灵敏地检测出胎儿特异点突变。高通量测序、数字PCR是“数字化”定量目标分子的平台，从单分子层面同时对大量DNA分子进行分析，准确度优于传统分析平台，从而在较低的胎儿浓度下进行精确的差异分析。而微滴数字PCR在检测时间和检测成本上都优于高通量测序，且相比高通量测序不受测序深度、覆盖度、均一性影响，不仅分析更简便，对突变的识别和计数更具优势，理论上可精确到单个突变分子的检测。目前已有文献报道利用数字PCR在多种点突变为主的单基因病的无创产前诊断，但在缺失型突变的检测上仍然是困难的。同时，需要明确，数字PCR和传统PCR方法一样，只能针对常见的突变和缺失，对于新的突变或罕见突变和缺失的检测仍存在障碍，需要逐步摸索完善方法学。但随着新方法的普及和大样本临床研究的推行，方法学的探索将逐渐成熟，地中海贫血的无创产前诊断有望走入临床应用。

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