外泌体在胰腺癌研究中的进展

时霄寒 金钢

外泌体在胰腺癌研究中的进展

时霄寒 金钢

外泌体(exosomes)是细胞主动分泌的小囊泡，起源于内涵体，直径约为40～150 nm。结构上，外泌体由脂质双层包裹细胞液而成，常含有线粒体、核糖体等细胞器。其囊液富含蛋白质如热休克蛋白、细胞信号蛋白等，以及核酸如信使RNA、小RNA、DNA等[1-4]。过去的十余年里，针对肿瘤，尤其胰腺癌外泌体的研究呈现爆炸式增长。这些研究结果显示，外泌体参与肿瘤的增生、血管生成、凋亡抑制，同时促进上皮间质转化、侵袭及转移、诱导免疫耐受及耐药性形成[1，5]。本文综述了外泌体在胰腺癌发生、发展中的重要作用，以及在肿瘤诊断、治疗方面的潜在价值。

一、外泌体在胰腺癌发生和发展中的作用机制

1．外泌体与胰腺癌细胞增殖：与其他上皮来源的肿瘤相比，胰腺癌的间质成分更多[6]。胰腺星状细胞(PSCs)是胰腺间质中的重要组成成分，正常情况下处于休眠状态，主要分布于胰腺血管周围[7]。在胰腺癌中，激活的PSCs释放富含miR-21的外泌体，可以促进肿瘤上皮细胞向间质细胞转化，增强肿瘤细胞的增殖能力，且促进细胞间质增生[8-9]。miR-21涉及多种肿瘤的发生和发展过程，有“原癌小RNA”之称。多项研究表明，miR-21过量表达与细胞增殖及侵袭力增强密切相关，且外泌体中miR-21的水平越高，患者预后越差[10]。同时，PSCs还会分泌大量炎症因子如IL-6、IL-8、IL-15等，通过自分泌、旁分泌的途径激活其他处于休眠状态的PSCs，释放更多肿瘤相关的外泌体，加速胰腺癌的进展[11]。此外，还有研究表明，胰腺癌细胞也会通过释放富含miR-155的外泌体，促进细胞间质的增生[12]。

2．外泌体与胰腺癌转移：转移是导致胰腺癌患者预后不良的重要因素。在多种肿瘤研究中均发现外泌体在转移过程中起关键作用。有关乳腺癌的实验研究发现，富含miR-200的外泌体可以促进乳腺癌的肺部转移，通过改变基因表达使远处组织细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞的定植[13]。在胰腺癌小鼠模型中发现，来源于胰腺癌的外泌体可以促进肝细胞微环境的纤维化(属于转移前的改变)，从而促进转移的发生。这个过程受多重机制的调节，开始于肝库佛细胞吞噬胰腺癌细胞释放的外泌体，其内富含巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)等细胞因子。这些细胞受细胞因子的刺激后又会产生致纤维化的细胞因子，诱导肝星状细胞产生纤连蛋白，建立纤维化的微环境，促进骨髓源性细胞进入，为胰腺癌细胞的生长及转移创造了良好的环境[14]。此外，还有研究显示来源于胰腺癌的富含CD44v6的外泌体，与胰腺癌淋巴结及肺组织的早期转移相关[15]。

3．外泌体与胰腺癌耐药性形成：鉴于外泌体在细胞之间信息传递的作用，其在胰腺癌化学药物治疗耐药性形成中很可能也发挥重要作用。研究发现，应用过顺铂化疗的肺癌患者，从其体内分离出的外泌体可以将已产生的耐药性转递给其他未接受过化疗的细胞[16]。同样，对多烯紫杉醇或阿霉素耐药的乳腺癌细胞，从其培养液中分离出的外泌体，可以使对化疗药物敏感的人乳腺癌细胞系MCF-7也产生耐药性[17]。另外，关于前列腺癌细胞系的实验研究发现，外泌体介导的多重耐药蛋白MDR-1的传递可能调控着对多烯紫杉醇的耐药性[18]。因此，胰腺癌的耐药性形成很可能也与外泌体关系密切，但仍需更多相关的实验研究证据加以证明。

4．外泌体与胰腺癌免疫耐受形成：巨噬细胞通常分为M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)[19]。M1型主要分泌大量炎症因子如IL-1、IL-6、IL-23和TNF，促进炎症反应，而M2型则分泌少量炎症因子，阻止T细胞增殖，抑制炎症反应[20]。目前研究认为，肿瘤细胞分泌的外泌体与巨噬细胞分化密切相关。实验结果显示，肿瘤细胞分泌的外泌体含有大量的MFG-E8，其与诱导巨噬细胞吞噬作用密切相关，而体外实验发现，在培养液中加入MFG-E8会使骨髓源性巨噬细胞更倾向于分化成M2型[21-22]。免疫组化试验证实，在胰腺癌侵袭的边界，多为M2型巨噬细胞，并且其数量与周围淋巴结转移程度及早期远处转移呈正相关，而与患者预后呈负相关[23-24]。但近期也有实验证据表明，由肿瘤外泌体引起的巨噬细胞极化与去极化可能并不像经典的M1和M2型分类，而是形成一种适合肿瘤生长的特殊类型。例如，用恶性胶质瘤细胞系来源的外泌体培养出的单核细胞既表达M2型的标志物CD163，又大量分泌M1型主要分泌的细胞因子IL-6、MCP-1以及VEGF等[25]。越来越多的研究表明，中性粒细胞的水平与患者预后息息相关，外周血中性粒细胞/淋巴细胞比值越高，患者预后越差[26]。通常认为中性粒细胞属于终末分化细胞，对肿瘤的发生和发展几乎没有作用，但现在研究发现，它们与巨噬细胞一样，可以转变为促进肿瘤生长的细胞表型，参与肿瘤的增生、血管生成、侵袭及免疫抑制等[27]。而这种转变很可能与巨噬细胞释放的富含白三烯的外泌体有关，但具体的机制仍有待研究[28]。此外，T细胞免疫也与患者预后密切相关。CD4+辅助性T细胞和CD8+毒性T细胞水平越高，患者预后越好，而CD4+调节性T细胞水平越高，患者预后越差[29]。现在有很多体内实验结果均证实，肿瘤外泌体可以促进CD4+调节性T细胞增殖[30]。IL-2是调节包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞增殖、分化等免疫细胞的重要因子。IL-2可以促进CD4+辅助性T细胞的增殖，但对CD4+调节性T细胞作用不明显，而TGF-β可以抑制IL-2的作用，并对维持CD4+调节性T细胞的表型有重要作用[31]。虽然目前还不能完全证实胰腺癌细胞分泌的外泌体中包含TGF-β，但可以肯定的是，这些外泌体能促进固有免疫细胞产生TGF-β，这可能在肿瘤免疫耐受的维持中起重要作用[14]。在肿瘤微环境中，CD4+调节性T细胞会分泌外泌体，抑制Th1反应并参与免疫耐受反应[32]。

二、外泌体在胰腺癌中的临床应用

1．外泌体作为诊断标志物：外泌体是由细胞主动分泌产生的囊泡，可以反映来源细胞的生理、病理状态[33]。而且可以通过近乎无创的方式从人体体液中获取，如唾液、血浆、尿液、乳汁等，这些特点使它迅速成为胰腺癌新兴的诊断标志物之一[34]。近期研究发现，在胰腺癌患者的体液中可以检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican-1，GPC1)阳性外泌体。根据外泌体的GPC1水平，可以很好地将胰腺癌患者与健康人及慢性胰腺炎患者相区分，而且其灵敏度及特异性均可达到100%。在胰腺癌小鼠模型实验中发现，GPC1阳性外泌体数量的增加速度与肿瘤负荷的增长速度相一致，甚至可以在影像学检测出可见肿瘤前，即发生与癌变相对应的数量增加。但由于GPC1阳性外泌体在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中也会增多，而使其难以成为胰腺癌早期诊断的标志物。目前GPC1在肿瘤发生和发展中的作用尚不清楚，更多关于GPC1与胰腺癌的研究值得期待[35]。

还有学者检测了胰腺癌患者外泌体中的小RNA，发现其中miR-21和miR-17-5-P对于胰腺癌的诊断有良好的灵敏度，但由于它们在多种肿瘤中都有表达，因此缺乏较好的特异性，也难以成为胰腺癌诊断的标志物[36]。近年来，有学者采用胰腺癌外泌体与血浆游离小RNA联合检测的方法诊断胰腺癌，单独检测胰腺癌外泌体标志物时，其敏感性为97%，血浆游离小RNA为71%，而联合检测时，敏感性可以达到100%，且特异性无降低，这种联合检测的结果可以将胰腺癌与正常胰腺、胰腺良性肿瘤及慢性胰腺炎相鉴别。这种联合检测方法集合了两种检测手段的优势，价格低、创伤小、仅需要不到2 ml血浆，可能是对胰腺癌早期诊断的重大突破，值得进行大规模临床研究[37]。外泌体也为胰腺癌个体化治疗提供了可能。以表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶向治疗为例，很多胰腺癌患者的肿瘤细胞都表达EGFR，且可以在外泌体中检测到[38]。近年来研究发现，如果在胰腺癌患者的外泌体中检测到K-ras基因突变，就认为该患者对EGFR靶向治疗不敏感[2]。

2．外泌体与胰腺癌治疗：近年来利用外泌体作为给药途径成为研究热点，通过外泌体给药可以更准确地到达作用部位、更好地发挥药物的药理作用。在体外实验中发现，胰腺癌细胞可以主动摄取人工置入的外泌体，有效诱导细胞毒性反应[39]。将紫杉醇导入外泌体，再将此外泌体放入前列腺癌细胞的培养液中，其发挥的细胞毒性作用要强于单纯将紫杉醇加入培养液中[40]。同样，在胰腺癌的细胞实验中也有类似的结果[41]。但这种方法的疗效与使用白蛋白紫杉醇的疗效或其他化疗方式的疗效相比，优劣尚不明确，还需要更多的研究加以证实。还有学者尝试通过阻断外泌体介导的细胞间信息交流来增强胰腺癌的治疗效果。体外实验证实，在培养液中加入肝素，可以抑制细胞摄取外泌体[42]。但近期实验结果显示，无论是单用吉西他滨组还是吉西他滨与依诺肝素联用组，与单用依诺肝素组相比，在无病生存率和总体生存率上均未见有统计学的差别[43]。此外，有学者提出使用外泌体作为免疫疗法的媒介，诱导产生肿瘤免疫反应。虽然目前取得的进展有限，但仍是一个胰腺癌治疗的新方向[44]。

三、结语

外泌体在胰腺癌细胞增殖、转移、耐药性、免疫调节、诊断及治疗等多个方面均发挥了重要作用。但从目前众多的相关研究来看，其中很多通路与机制仍不甚清楚，尚未能形成比较明确的研究结果。继续对胰腺癌外泌体进行深度研究，能帮助我们更好地了解胰腺癌的生物学行为，有助于早日解决“胰腺癌”难题，同时也为更快地找到胰腺癌新的诊断标记物和新的治疗方式提供了可能。

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(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.018

200433 上海，第二军医大学长海医院肝胆胰外科

金钢，Email：jingang@sohu.com

2016-10-31)