基因功能的研究方法

王雪颖 米丽娜 杨铮 陈琪 刘陶迪 周好乐

·综述·

基因功能的研究方法

王雪颖 米丽娜 杨铮 陈琪 刘陶迪 周好乐

随着后基因组时代的到来，如何确定新基因的功能和已知基因的新功能已经成为了一个主要研究方向。现今的研究方法包括生物信息学预测、基因转导、反义技术等方法，而一些新技术的涌现，也为研究提供了新思路和新见解。

基因功能；生物信息学；反义技术

1986年，美国诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco在《Science》上发表的一篇名为“癌症研究的转折点——测定人类基因组序列”的短文中首次提出人类基因组计划(human genome project，HGP)，此后生命科学逐渐进入后基因组时代。怎样确定遗传信息和基因的功能，将是现在乃至未来研究重点和方向。本文介绍了研究基因功能常用的一些方法以及一些新思路。

1 基因功能的预测

结构决定功能是众所周知的，对基因功能的研究可以从结构上进行合理地预测或运用生物信息学方法，再通过实验学方法进行验证加以确定。

1.1 从结构方面预测基因的功能 核苷酸的排列顺序决定了基因的功能，利用DNA或蛋白质序列之间的相似性来推断基因的功能是第一种进行测试的方法也是迄今为止使用最广泛的方法。通过对蛋白质空间结构进行推导和探索，可以推测该蛋白质的功能，为预测其基因的功能提供了有价值的信息以供参考。

1.2 运用生物信息学预测基因的功能 生物信息学(Bioinformatics)是以DNA和蛋白质为研究对象，计算机为主要工具，对DNA和蛋白质的序列和结构进行提取、加工、分析等。生物信息学分析是确定在体内的DNA和蛋白质之间的相互作用的有效途径，已成为近年来非常受欢迎的方法[1]。研究人员已用微阵列表达数据、蛋白质的三维结构、蛋白质结构域、蛋白-蛋白相互作用网络、系统发生谱来预测基因的功能[2]。孙泽强等[3]利用现有的生物医学文献和基因组信息来确定基因之间的功能关系，开发了一个基于web的生物信息学的软件——基因功能关系助手(GFRA)。GFRA可发现基因之间的功能联系并将其分类。实现了从文本流和文本库中挖掘知识，鉴定新基因之间的功能关系，对于验证和分析由微阵列实验提出的基因关联有很大帮助。

2 基因的时空表达谱分析

基因的时空表达谱包括蛋白质和mRNA两个水平，基因在个体的不同组织和细胞中以及不同的发育阶段表达均不相同，所以在研究基因功能之前，要分析基因的时空表达谱[4]。常用的方法有原位杂交、免疫组织化学、蛋白印迹技术、实时PCR技术等。

3 基因功能的实验学方法

基因功能的实验学方法既可以研究基因功能，也可以对预测后的基因加以验证。

3.1 基因转导 要了解一个基因有何功能，可以通过基因转导(gene transduction)方法把目的基因有效安全地导入到靶细胞中，继而观察这个基因在细胞中的表达，此方法可分为利用非病毒的转导方法和利用病毒的转导方法。非病毒基因转导要比病毒转导方法安全，但其在组织中的表达是暂时的。可以通过DNA直接注射、脂质体介导DNA或受体介导，将目的基因转入到细胞中。而在病毒转导方法中多种病毒对哺乳动物细胞具有很强的感染能力，并能在宿主细胞内复制表达。利用这一特性，选择某些对人体无害的病毒，通过DNA重组技术，构建病毒载体。病毒方法导入基因的效率一般高于非病毒方法。

3.2 人工染色体的转导 在常用的酵母人工染色体(YACs)、细菌人工染色体(BACs)等基础上研究出一种全新的载体系统——人类人工染色体(human artificial chromosomes，HACs)。HACs由着丝粒、端粒和复制起点组成，其作为载体则可以携带基因的所有外显子或多个基因以及完整基因和附近调控区的大片段DNA，从而将目的基因调控序列一并导入细胞内，避免了整合到人其他染色体的可能及位置效应，大大提高了基因治疗的有效性和安全性，不存在大小上限的DNA克隆到HAC——整个基因组座位与所有调节元件都可以使用[5]。HACs对于功能基因组学，基因治疗和合成生物学其代表了一个新的有前景的游离基因系统[6]。

3.3 基因编辑新技术 基因编辑新技术是指经过人工改造的核酸酶介导的基因组编辑技术(genome editing with engineered nucleases)，也称RNA引导性基因编辑技术[7]。其主要有类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和RNA引导的CRISPR-Cas9核酸酶技术(CRISPR-Cas9 RGNs)。

3.3.1 TALEN TALE来自于植物黄单胞菌(Xanthomonas)，是具有转录激活功能的蛋白。宿主基因启动子区的相应核苷酸序列与其DNA结构域进行特异性结合，从而激活基因表达。TALEN技术已经广泛应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象[8]。

3.3.2 ZFN ZFN有与TALEN截然不同的DNA识别和结合域。ZFN由锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)和FokⅠ核酸内切酶组成，ZFN与相应的FokⅠ域形成异源二聚体，从而使FokⅠ域激活，催化DNA双链在特定位点断裂，再根据模板决定采用同源重组机制来修复断裂或非同源末端连接的方法。迄今为止，ZFN已被用于靶向许多基因在不同的生物体，例如大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、玉米等生物的细胞在人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变[9]。

3.3.3 CRISPR-Cas9 RGNs 通过一段短的引导RNA(guide RNA)来识别特定的DNA序列，改变这段引导RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上。使DNA结构域与不同转录调控蛋白结合，从而对特定基因的转录激活或抑制[10-11]。此方法具有操作简单、特异性高的特点，已成为当下的研究热点。

3.4 反义技术 反义技术(antisense techniques)是根据碱基互补原理，干扰DNA双链的解螺旋、复制、转录以及mRNA的剪接加工和翻译等各个阶段。包括反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASON)技术、核酶(Ribozyme)技术和小RNA干扰(small interfering，siRNA)技术。

3.4.1 反义寡核苷酸技术 利用基因重组技术，遵循碱基互补配对原则，通过构建人工表达载体，对基因表达的多个环节进行干扰，从而调节细胞的生长分化过程。与其他基因或蛋白抑制剂相比，反义寡核苷酸具有特异性高、抑制基因范围广以及抑制靶基因程度可调控等独特的优点。

3.4.2 核酶技术 核酶是具有催化功能的小分子RNA，又称催化性RNA。具有酶的活性，可催化特定的RNA降解。核酶技术就是利用核酶特有的催化活性，通过碱基配对原则，灭活特异性靶RNA分子。其空间结构稳定，所以催化效率比反义寡核苷酸高[12]。常见的核酶形态有三种：锤头状、发夹状和斧头状。

3.4.3 小RNA干扰技术 siRNA是细胞内一类双链RNA在特定情况下通过一定酶切机制，转变为具有特定序列的小片段RNA。siRNA与一些蛋白质RNA诱导的沉默复合物(RNA-Induced silencing complex，RISC)，与特异性靶mRNA结合使其降解，阻断翻译过程。siRNA能够通过RNA干扰(RNAi)途径催化沉默特定的基因，是有吸引力的备选治疗方法，适用于大多数疾病，包括遗传疾病和癌症[13]。它可以用来抑制体外和体内特定基因的表达，具有特异、高效、稳定性强、操作简便等特点[14]。Beronja等[15]开发了用于皮肤RNAi介导的基因功能分析的方法，它采用超声引导在9只胚胎期小鼠子宫羊膜腔微量注射慢病毒载体，使其快速、有效和稳定的转导到小鼠皮肤上。这个技术不需要动物交配，在操作和和表型分析之间可能只需要短短几天的时间，用最简单的形式，比如说通过shRNA介导的基因敲除的单基因功能分析。他们的技术极大地扩展了在表皮生物学中存在的突出问题的全面功能检查。

3.5 微阵列分析 微阵列(microarray)是近年来发展起来的一项研究基因功能的新技术。指的是由许多DNA样品或寡核苷酸，密集排列于玻片、硅片或尼龙膜等固相支持物上与模板进行杂交，通过计算机获取图像信息从而进行分析处理。采用微阵列技术，可以对生物体在不同的生长发育阶段或不同的生理状态下DNA或RNA表达水平进行检测，随着分子生物学的进步，微阵列已成为探查人类复杂疾病的重要资源，可用于快速检测大规模DNA序列多态性、基因组表达谱、基因差异表达、疾病相关基因[16-17]。

3.6 单倍体胚胎干细胞研究 单倍体胚胎干细胞(Haploid embryonic stem cells，haESCs)是一种对胚胎干细胞新的应用方式。由于单倍体细胞仅含有单套染色体，适合于基因分析，且haESC拥有在体外无限增殖，并可以分化成多种功能细胞、组织以及器官的细胞类群的特性[18-19]。研究人员通过对单倍体胚胎干细胞中的某些基因进行修饰，从而研究特定基因在受精过程中的功能[20]。这些单倍体胚胎干细胞的明显特征使自己不仅成为了在细胞水平上对基因筛查的有价值的工具，而且也作为一种研究哺乳动物基因功能新的理想工具[21]。

HaESC可分为孤雄单倍体胚胎干细胞(androgenetic haploid mbrvonic stem cell，AG-haESC)和孤雌单倍体胚胎干细胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cell，PG-haESC)。在几年前Elling U等[22]和Leeb M等[23]用不同的方法建立了小鼠孤雌胚胎源单倍体胚胎干细胞系；而Yang H等[24]建立了孤雄单倍体干细胞系，采用了去除受精卵中的雌原核和向去核的卵母细胞中注射成熟精子的头部2种不同的方法，从此开启了关于多种细胞及发育过程基因有效功能学筛选的相关研究。随着haESC的研究价值逐步提高，涌现了越来越多关于它的研究成果，比如，利用基因修饰获得的haESC的转基因动物。Monfort A等[25]利用单倍体小鼠胚胎干细胞(ESCs)使X染色体失活，从而识别出哪些基因的表达是需要X染色体抑制的。进一步证明了haESC不仅在遗传筛查中发挥作用，更说明了其在基因功能研究方面的价值。

4 展望

基因功能的研究方法是我们研究疾病的重要途径之一。本文所介绍的方法各有优良，但相辅相成。随着研究的不断发展和深入，我们不仅要完善现有的方法，而且要继续发展、探索一些新技术。基因作为人类传承的根本，是人类生长发育过程中不可缺少的一部分，更在人类的疾病、衰老和死亡过程中发挥着功能。但人体中的基因数以千万，大多数基因的功能尚未发现，如何揭开它的神秘面纱，就需要更多更新的方法来帮助研究人员全面了解基因如何在体内发挥功能以及相互协调，进而探索出人类生老病死的奥秘。

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With the advent of the post-genomic era，it has become a major research direction to determine the unknown functions of the new genes and the new functions of the known genes.The current research methods include bioinformatics prediction，gene transduction，antisense technology，and so on.Meanwhile，the emergence of other new technologies provides some new ideas and insights for the related studies.

Gene function；Bioinformatics；Antisense technology

2016-07-06)

国家自然科学基金项目(81260111)；内蒙古医科大学中青年人才团队项目(NYTD-2015003)

1005-619X(2017)02-0131-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.007

010100 内蒙古医科大学心身医学研究室

刘陶迪，周好乐