具重金属抗性产酸菌的分离及生物学特性研究

邓新辉，彭扶风，陈韵声，何权运，孔乐群，李贝贝，张霞

1.湖南工业大学生命科学与化学学院，湖南 株洲 412007；2.长沙市雅礼中学，湖南 长沙 410007

具重金属抗性产酸菌的分离及生物学特性研究

邓新辉1*，彭扶风2，陈韵声1，何权运1，孔乐群1，李贝贝1，张霞1

1.湖南工业大学生命科学与化学学院，湖南 株洲 412007；2.长沙市雅礼中学，湖南 长沙 410007

铅锌冶炼厂周边区域遭受复合重金属的严重污染，目前单一重金属污染土壤的修复技术比较成熟，而针对复合重金属严重污染土壤的治理技术有待进一步研发。本研究采集铅锌冶炼厂附近重金属污染土壤，试图从土壤中分离出具重金属抗性的产酸菌，并应用于浸出修复复合重金属重污染土壤。通过野外取样调查、分子生物学鉴定和显微镜观察等分析测试手段，从铅锌冶炼厂附近土壤中成功分离出一株具强重金属抗性的产酸菌，经鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger），命名为F2。对其重金属抗性和浸出修复能力进行研究，结果表明：黑曲霉F2对Pb、Zn、Cd和Cu的最大耐受质量浓度分别为8 500、6 000、2 200和2 500 mg∙L-1。在高浓度重金属的胁迫下，培养前期菌株处于驯化阶段，不生长或生长很慢，培养后期生长速度加快。将黑曲霉接种到50 mL培养液中培养7 d，培养液的pH值从7.00降至2.40，将2.5 g灭菌土壤加入50 mL培养液中，接种1 mL菌液，置于恒温振荡培养箱中（温度28 ℃、转速120 r·min-1）培养15 d，Pb、Zn、Cd和Cu的浸出百分率分别为46.79%、52.01%、29.40%和75.70%，对4种重金属的总浸出率达59.54%。由此可见，黑曲霉不但具有很强的重金属耐受性，还具有较大的浸出修复重金属污染土壤的潜力，具备一定的研究价值。

黑曲霉；重金属抗性；土壤；浸出修复

目前，重金属污染土壤问题已受到国内外专家学者的密切关注，尤其冶炼行业给土壤带来的重金属污染不容忽视。邓新辉等（邓新辉等，2015；Deng et al.，2012a）的研究表明了某铅锌冶炼厂废渣堆场及附近区域土壤遭受到Pb、Zn、Cd和Cu等复合重金属的严重污染。刘勇等（2015，2014）以关中西部某铅锌冶炼厂区内土壤及周围农田为研究对象，结果表明厂区内土壤已受到Pb、Zn、Cu、As、Cd和Hg的严重污染，厂区周围农田存在重金属潜在生态危害，其中Cd和Hg的污染水平为重度污染，Pb的污染水平为中度污染。徐玉霞等（2014a，2014b）的研究发现关中西部某铅锌冶炼厂周围耕地中Pb、Zn、Cu、Cd、Cr、Hg、As和Ni的平均含量均高于陕西省土壤元素背景值，铅锌冶炼厂周围耕地土壤已达到中重度污染程度，其中重金属Pb、Hg和Zn污染尤其严重。由此可见，冶炼厂区内及附近区域土壤已遭受复合重金属的严重污染。

治理重金属污染土壤问题已成为国内外专家学者的研究焦点，目前治理单一重金属污染土壤的技术比较成熟，而对复合重金属污染土壤的治理技术还有待研究发展（曹心德等，2011）。采用微生物技术治理重金属污染土壤的前提是必须有重金属抗性菌，多数菌株只对某一种或某两种重金属具有抗性，而同时对4种或4种以上重金属具有抗性的菌株目前报道尚少。微生物浸出修复法是指利用自然界中微生物的直接作用或其代谢产物的间接作用，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，将固相中的某些不溶性成分（如重金属、硫及其它金属）分离浸提出来的一种技术，该技术的原理源自于微生物湿法冶金（周顺桂等，2002），也适应于复合重金属污染土壤的治理（Deng et al.，2012b）。用于浸出修复重金属污染土壤的菌种有自养型和异养型两种，自养型菌种主要有氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌（Liu et al.，2008；Shi et al.，2004）；异养型菌种主要是一些异养真菌，如Aspergillus nige，Penicillium simplicissimum和Penicillium chrysogenum能通过代谢产生大量小分子有机酸，这些有机酸可以溶解、螯合土壤中的重金属，达到提取土壤中重金属的目的，是一种有效的微生物浸提土壤重金属的方法（Sabra et al.，2012；Amiri et al.，2011）。

本研究试图从冶炼厂附近复合重金属污染土壤中分离具产酸特性的重金属抗性菌株，旨在寻找对多种重金属具有一定抗性的菌种，通过其新陈代谢产生的有机酸来提取土壤中的重金属，以期为发展一项采用微生物浸出修复复合重金属污染土壤的技术提供菌种资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集

在湖南某冶炼厂附近1000 m以内采集表层（0～20 cm）土壤，混合均匀，一部分保存于冰箱用于具重金属抗性产酸菌的分离；另一部分去掉杂质，晒干，磨碎，过20目筛，置于恒温干燥箱中干燥24 h至恒重，装进密封袋保存于干燥塔内备用，部分送武汉楚江环保科技有限公司采用原子吸收法测量其重金属含量，得出Pb、Zn、Cd和Cu在土壤中的质量分数分别为486、6.75×103、319和486 mg∙kg-1。

1.2 培养基

用于菌种筛选的固体培养基为LB培养基。液体培养基的主要成分为：葡萄糖90 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1000 mL。所有试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 具重金属抗性产酸菌的分离筛选

称取10 g土壤样品于150 mL已灭菌的锥形瓶中，加入10 mL灭菌培养基，于30 ℃培养箱中培养4 d，4 d后取1 mL泥浆于装有9 mL灭菌水的试管中，充分摇匀，得到稀释10倍的土壤悬液，记为10-1；从10-1管里取1 mL放入另一支装有9 mL灭菌水的试管中，摇匀，记为10-2；依次稀释，将土壤泥浆样品稀释成10-3、10-4、10-5和10-6。用移液枪从10-4、10-5和10-6稀释液中分别取0.1 mL接种于含重金属的LB固体培养基上（重金属的质量浓度为：Pb 1500 mg∙L-1、Cd 80 mg∙L-1、Cu 2000 mg∙L-1和Zn 2000 mg∙L-1），轻轻转动平板，将菌液用三角棒涂布于培养基上，将平板倒置于30 ℃培养箱中培养5 d，观察菌落的形态，采用常规平板划线法分离纯化。再用无菌接种针挑取不同形态的菌落，接种于察氏液体培养基中，置于30 ℃恒温振荡培养箱中培养，自第2天开始用灭菌酸度计测量培养基pH值，找出能降低培养基pH值的菌株，置于4 ℃冰箱中保存备用。以上所用介质均在121 ℃下灭菌30 min。

1.4 菌株的重金属抗性研究

用直径为0.9 cm的圆形接种环于平板菌落上沾取孢子接种到含不同重金属浓度的固体培养基表面，每天用直尺测量菌落直径，记录数据，通过计算菌落直径的变化来衡量菌株对重金属的抗性。添加单一重金属的培养时间为7～8 d，添加复合重金属的培养时间为12 d。重金属在培养基中的质量浓度设置如下：Cu分别为1800、2000和2500 mg∙L-1，Zn分别为4000、5000、6000和7000 mg∙L-1，Pb分别为6000、7000和8000 mg∙L-1，Cd分别为1800、2000、2200和2400 mg∙L-1。

1.5 菌株产酸性能研究

用移液枪吸取无菌水于平板菌落上，荡洗平板表面孢子，再将孢子悬液接种于液体培养基中，自培养的第2天开始用灭菌酸度计测量培养基pH值，直至培养基pH值不再降低。

1.6 菌株形态学和基因鉴定

1.6.1 光学显微镜观察

用吸管吸取1滴菌株培养液于载玻片中央，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。

1.6.2 分子鉴定

将菌种接于察氏培养基平板上培养5 d，送长沙爱科博生物科技有限公司测定18s rDNA、ITS4和ITS5序列，鉴定菌种。采用优化的CTAB法提取基因组DNA，以提取到的基因组DNA为模板，以ITS4/ITS5为引物（ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′）；扩增ITS区序列，以NS1/NS8为引物（ZJ-NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；ZJ-NS8：TCCGCAGGTTCACCT ACGGA）；扩增18s DNA区序列，扩增产物做PCR并纯化、测序，然后以GenBank数据库作为参考对测序结果进行BLAST分析。

1.7 菌株对重金属的浸出修复能力研究

取上述察氏液体培养基49 mL装入250 mL锥形瓶中，接种1 mL菌株孢子液，于电子天平上称重，记下重量，置于恒温振荡培养箱中培养7 d后添加2.5 g污染土壤，放回恒温振荡培养箱，7 d后再次取出，先恒重，再过滤。由于水分蒸发而失去的重量用无菌水补充，取滤液，采用ICP-AES测定滤液中重金属含量。重金属浸出率（%）等于浸出后滤液中重金属质量（mg）除以浸出前重金属质量（mg）再乘以100%，浸出前重金属的质量以2.5 g土壤计算，故得出2.5 g土壤中Pb、Zn、Cd和Cu的质量分别为0.0012、16.875、0.7975和0.0012 mg。

图1 菌株对重金属Cu、Zn、Pb和Cd的抗性图Fig.1 The resistance strain of Cu, Zn, Pb and Cd

2 结果与讨论

2.1 菌株对重金属的抗性

如图1a所示为菌株接种在不同Cu质量浓度培养基上的生长情况，第1天接种的菌落直径均为0.90 cm。当Cu质量浓度为1800 mg∙L-1时，菌株培养7 d后，菌落直径达2.07 cm，7 d增长了1.17 cm；而Cu质量浓度分别为2000和2500 mg∙L-1时，培养7 d后，菌落直径分别只有1.20和1.07 cm，分别只增长了0.30和0.17 cm。因此，当Cu质量浓度为1800 mg∙L-1时，菌株的生长明显快于Cu质量浓度为2000和2500 mg∙L-1，尤其当Cu质量浓度为2500 mg∙L-1时，菌株的生长接近停滞，故菌株对Cu的最大耐受质量浓度为2500 mg∙L-1。

图1b所示为菌株接种在不同Zn质量浓度培养基上的生长情况。从第2天开始，接种在Zn质量浓度为4000 mg∙L-1的培养基上的菌株生长了，直径从0.90 cm增大至1.03 cm，其余浓度处理均未生长；培养基中Zn的质量浓度分别为4000和5000 mg∙L-1时，至培养的第3天，菌株的菌落直径分别增大至1.10 cm和0.93 cm；当Zn质量浓度为6000和7000 mg∙L-1时，菌株从第4天开始有缓慢生长，菌落直径均增大至0.93 cm，其中质量浓度为6000 mg∙L-1的菌株继续缓慢生长，至第7天时菌落直径增大至1.10 cm，而此时Zn质量浓度为7000 mg∙L-1的菌落直径增大至1.00 cm。由此可见，当Zn的质量浓度为6000 mg∙L-1时，菌株出现缓慢生长，当Zn的质量浓度为7000 mg∙L-1，菌株生长基本停滞，故菌株对Zn的最大耐受质量浓度为6000 mg∙L-1。

菌株对Pb的抗性如图1c所示，当Pb质量浓度为7000 mg∙L-1时，菌株从第2天开始缓慢生长，至第3天菌落直径从0.90 cm增大至1.07 cm，第4天开始菌株快速生长，菌落直径增大至1.77 cm，直到第7天增大至4.90 cm；Pb质量浓度分别为8000和7000 mg∙L-1时菌株的生长趋势一致，但前者速度明显减慢；Pb质量浓度为8500 mg∙L-1时菌株从第5天才开始生长，至第7天时菌落直径达1.40 cm；而Pb质量浓度为9000 mg∙L-1时菌株几乎不生长。因此，菌株对Pb的最大耐受质量浓度为8500 mg∙L-1。

菌株对Cd的抗性见图1d，当Cd质量浓度为1800 mg∙L-1时，菌株的生长基本不受Cd的影响，从培养的第2天开始，菌株呈直线生长；当Cd质量浓度为2000 mg∙L-1，从第4天才开始生长，至第7天时菌落直径由0.90 cm增至1.90 cm；当Cd质量浓度为2200 mg∙L-1时，从第4天才开始缓慢生长，至第7天时菌落直径才由0.90 cm增至1.30 cm；当Cd质量浓度为2400 mg∙L-1时，菌株基本不生长，至第7天时菌落直径只有1.07 cm，故菌株能耐受的最大Cd质量浓度为2200 mg∙L-1。

2.2 菌株培养液pH值的变化

采用pH值为7.0的培养液培养菌株（图2），培养的第3天，培养液pH值降至3.39，以后每天逐步降低，直至第8天时降至2.40。培养基pH值的降低是由于在培养过程中，菌株代谢产生了小分子有机酸（Deng et al.，2013）。至于菌株在代谢过程中产生了哪些有机酸及其他产物，有待进一步通过液相色谱、质谱等分析测试手段研究（Ren et al.，2009）。

图2 菌株培养液pH值图Fig.2 Medium pH value of the strain

2.3 具重金属抗性产酸菌的分离鉴定

从图3可看出，菌丝呈黑褐色、发达，多分枝，分生孢子球形，呈黑色，菌落表面粗糙，结合分子生物学鉴定和系统发育树（图4），该具重金属抗性产酸菌为黑曲霉，拉丁名为Aspergillus niger，命名为F2。

图3 黑曲霉菌丝及孢子形态(×40)Fig.3 Mycelium and spore morphology of Aspergillus niger F2

2.4 黑曲霉对重金属的浸出效率

黑曲霉F2对污染土壤中重金属Pb、Zn、Cd和Cu的浸出效率如图5所示，其中Pb的浸出百分率为46.79%，Zn的浸出百分率为52.01%、Cd的浸出百分率为29.40%，Cu的浸出百分率为75.70%，换算得出50 mL液体培养基中能浸出10.52 mg重金属，即4种重金属的总浸出率达59.54%。根据已有文献报道，在相同条件下（温度、培养基和恒温振荡培养箱转速相同），黑曲霉F2对土壤中重金属的总浸出率与产黄青霉相当（Ahmad et al.，2011），证明该菌株具有很高的应用价值，因此，有必要深入研究黑曲霉F2产酸的培养基组分及代谢条件，进一步提高黑曲霉对重金属的浸出率，了解其代谢途径，研究其浸出机理，发展一项黑曲霉F2浸出修复重金属污染土壤的技术。

3 结论

（1）黑曲霉具有很强的重金属耐受性，在含高浓度重金属的培养过程中，培养前期菌株处于接受重金属的驯化阶段，不生长或生长很慢，培养后期生长速度加快。黑曲霉对Pb、Zn、Cd和Cu的最大耐受浓度分别为8500、6000、2200和2500 mg∙L-1。

（2）黑曲霉对重金属污染土壤的浸出修复潜力大，能将50 mL液体培养基的pH值从7.0降至2.40，对Pb、Zn、Cd和Cu的浸出百分率分别为46.79%、52.01%、29.40%和75.70%，对4种重金属的总浸出率达59.54%。

图4 基于黑曲霉ITS序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequence of Aspergillus niger F2

图5 黑曲霉浸出重金属图Fig.5 Heavy metal bioleaching efficiency of Aspergillus niger F2

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Study on Isolating of the Strain Having the Ability of Heavy Metal Resistance and Producing Organic Acid

DENG Xinhui1*, PENG Fufeng2, CHEN Yunsheng1, HE Quanyun1, KONG Lequn1, LI Beibei1, ZHANG Xia1
1.College of Life Sciences and Chemistry of Hunan University of Technology, Zhuzhou 412007, China; 2.Yali High School, Changsha 410007, China

The soil in the surrounding area of Pb/Zn smeltery was contaminated by heavy metals such as Pb, Zn, Cd and Cu et al.The remediation technology for single heavy metal contaminated soil is already mature, but it needs further development for the seriously heavy metals compound contaminated soil.In the paper, the soil was collected in the surrounding area of Pb/Zn smeltery, and the microbiology having not only the ability of heavy metal resistance but also the ability of producing acid would be selected and isolated in order to being used to remedy the contaminated soil.Through field sampling and surveying, molecular biological identification, microscopic examination, a strain was selected from the soil samples which was indentified as Aspergillus niger and named as F2, the ability of heavy metal resistant and bioleaching remediation was studied in the paper.The results show: The largest concentration of resistance to Pb, Zn, Cd and Cu of Aspergillus niger F2 is 8 500, 6 000, 2 200 and 2 500 mg∙L-1, the largest concentration of resistance to the compound of Pb, Zn, Cd and Cu is 105, 2 400, 2 200 and 2 400 mg∙L-1.The growth of Aspergillus niger F2 on LB medium containing high concentrations of heavy metals was faster in the later stage than in the early stage.The pH value of liquid medium was degraded from 7.00 to 2.40 in 7 days.2.5 g sterilized soil was added into 49 mL liquid medium, 1 mL spore suspension liquid was inoculated, then put in 28 ℃ and 120 r·min-1orbital shaker incubator, after 15 days, the bioleaching efficiency of Pb, Zn, Cd and Cu was 46.79%, 52.01%, 29.40% and 75.70% respectively, the total bioleaching efficiency of Pb, Zn, Cd and Cu was 59.54%.Thus Aspergillus niger F2 has large ability of heavy metal resistance and good applied value of bioleaching remediation on heavy metal contaminated soil.

Aspergillus; niger; heavy metal resistance; soil bioleaching

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.10.019

X172

A

1674-5906（2016）10-1727-06

邓新辉, 彭扶风, 陈韵声, 何权运, 孔乐群, 李贝贝, 张霞.2016.具重金属抗性产酸菌的分离及生物学特性研究[J].生态环境学报, 25(10): 1727-1732.

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国家自然科学基金项目（51474102）；湖南省自然科学基金项目（2015JJ3059）；湖南省大学生创新项目

邓新辉（1974年生），女，博士研究生，主要从事重金属污染土壤研究。E-mail: xhdeng2007@126.com *通信作者

2016-05-26