骨髓间充质干细胞治疗阿尔茨海默病的研究进展

王回 石晶 卞合涛 闫中瑞

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是目前认为是一种神经系统退行性疾病，其临床特征为进行性记忆丧失、行为与学习障碍和认知功能障碍，老年人中最常见的痴呆症[1-3]。AD的病理特征包括细胞外以β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积为核心老年斑、细胞内聚集的神经纤维缠结、tau蛋白过度磷酸化、突触功能障碍以及颞叶神经元丧失为主[1-3]。目前，对于AD尚没有效的治疗方法。其中细胞移植替代丢失的神经元使之功能恢复为AD等神经变性疾病的治疗提供了一个崭新的思路。

一、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 的概述。

BMSCs具有自我复制及分化潜能。这些细胞表达间充质细胞或内皮细胞标志物以及粘附分子，如CD105、CD73、CD90、CD106、CD166、CD29，但不表达造血干细胞标志物，如CD11、CD14、CD34、CD45、CD79，CD19和HLA-DR等。近年来很多研究表明BMSCs在体内外由多种因子诱导下可以跨胚层向神经样细胞分化[4]。BMSCs治疗AD似乎是一个非常有吸引力的选择。BMSCs移植治疗一般来自自体组织，无伦理争议。BMSCs具有体外很容易培养、扩增简单、免疫原性弱、安全性好和基因突变性弱等优点，被认为是细胞移植治疗神经系统疾病理想的种子细胞[4，5]。

二、BMSCs移植方法

目前BMSCs移植多在动物实验，使用Aβ、药物及转基因技术制作AD动物模型，移植方法有立体定向途径，直接注入病变部位。经静脉移植途径，创伤小、风险低易操作，但有部分细胞滞留在外周器官，到达病灶的细胞量偏少，还有侧脑室注射、动脉移植、腰椎穿刺移植、鼻内移植等移植方法，在动物模型中以侧脑室、静脉移植使用较多。其中经鼻内途径移植作为一种新兴的移植手段越来越受到关注,为非侵害性的方法，因鼻部解剖结构距离脑部较近，移植细胞不必经过较长的路径即可接近脑组织，而且腔黏膜具有丰富的血管和淋巴管，吸收面积大，具有进入颅内的便利条件[6-9]。直接移植BMSCs可以迁移到病灶，Li等[10]将PKH26标记BMSCs经尾静脉注射AD大鼠14 d后，在大鼠海马区可以发现PKH26阳性BMSCs，在AD动物模型中的 PKH26阳性细胞明显多于正常对照组。说明移植BMSC不仅能通过血脑屏障，而且能在AD大鼠海马存活，并能改善AD大鼠的学习障碍。另外移植经基因修饰过BMSCs，或者在体外诱导BMSCs分化为神经细胞再植入大脑，可提高移植BMSCs存活率，并提供多种免疫调节和神经保护作用[11]。较早期时Kopen 等[12]在新生鼠侧脑室内注入标记的BMSCs后，发现逐渐迁移至小脑及前脑并表达胶质纤维酸性蛋白(glial fiber acidic protein，GFAP)，GFAP主要存在于星形细胞内，提示BMSCs有分化为神经细胞的功能。随后Deng等[13]报道在体外成功将人BMSCs定向诱导分化为神经元细胞。

三、BMSCs可分化为神经细胞

理论上在体外将BMSCs诱导分化为神经细胞，再移植入AD动物模型脑内可避免外BMSCs不恰当分化，提高存活率，体外实验常用抗氧化剂、神经细胞生长因子、神经细胞共培养、基因转染、中药制剂等定向分化诱导方法[11-16]。Joe等[14]近期使用白藜芦醇诱导可促进人BMSCs分化为神经元，经其处理的BMSCs显著增加表达神经前体细胞标记物巢蛋白、CD133和 GFAP。这种作用是通过去乙酰化酶抑制剂ex527处理后消失，其机制可能是白藜芦醇激活乙酰化酶。白藜芦醇有抗氧化、抗自由基、抗菌、抗癌的等多种药理生物活性作用。抗氧化剂咯利普兰抑制抑制磷酸二酯酶4 (phosphodiesterases 4，PDEs4)可促进人BMSCs分化为神经元，其通过抑制PDEs4的活性，增加细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine phosphate, cAMP)浓度，可以促进轴突的伸长，促进神经元的修复[15]。近期一项研究，粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)联合缺氧预处理可调节提高BMSCs的增殖、神经分化和迁移能力，提高移植细胞的存活率[16]，G-CSF是临床上常用的药物，具有促进细胞增殖和分化等重要药理作用。缺氧预处理BMSCs及使用抗炎、抗氧化等药物培养BMSCs可能成为未来细胞移植治疗AD的一个新的方法。

四、BMSCs减少可AD脑内Aβ沉积并逆转AD病理变化

既往研究AD动物模型海马区Aβ的减少可能预防和治疗AD[3]。Lee等[17]通过将BMSCs直接注射在AD动物模型海马齿状回附近有效减少脑组织Aβ累积，这表明BMSCs具有清除Aβ沉积和/或阻断Aβ沉积形成。Babaei等[18]观察到脑移植BMSCs可改善淀粉样前体蛋白和早老素双转基因AD小鼠模型的认知功能。此外，发现在移植BMSCs的小鼠大脑内tau蛋白过度磷酸化水平降低，其中tau蛋白过度磷酸化被认为是AD的病理特征。同时证明脑内注射骨髓的MSCs也改善化学剂和年龄诱导的AD模型大鼠学习和记忆[18]。此外，Kim等[19]研究发现在人脐带血来源的间充质干细胞和小胶质细胞的作用下释放细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule, sICAM-1)，诱导Aβ降解酶的表达，提示这是间充质干细胞参与诱导Aβ降解的一种机制。Bae等[20]研究也证实BMSCs降低脑内Aβ沉积，同时发现在AD患者的大脑蛋白动力蛋白1和突触蛋白1的表达通常会下降，在BMSCs治疗AD动物模型的大脑则增加，这两种蛋白是神经突触传递的关键蛋白，对维持突触的功能用重要意义。最近一项研究，在APP/PS1转基因AD小鼠经尾静脉注入BMSCs 28 d后，海马区Aβ斑块面积减少，发现斑块数量增加与降低BMSCs治疗量相关，表明静脉全身移植BMSCs可降解Aβ和减轻Aβ的神经毒性，逆转AD的病理进展[21]。Liu等[22]采用腺病毒转染技术，将反义寡核苷酸937修饰的BMSCs移植AD小鼠，显著降低Aβ沉积，增加脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)表达的水平，智能及行为学检测BMSCs治疗组AD小鼠认知功能与对照组明显改善，水迷宫检测提示AD小鼠记忆力提高，同时检测到Brn-4蛋白水平升高，提示经修饰过的BMSCs移植可大幅提高对AD的治疗效果，可能通过的提高Brn-4蛋白表达水平。目前研究认为Brn-4是一种转录因子，可参与神经细胞生长和分化，在神经系统发育中起着至关重要的作用[23]。

五、BMSCs参与调控小胶质细胞的激活及调节炎症反应

很多学者研究发现Aβ可引发小胶质细胞炎性反应，炎症反应已证明在AD的病理进展中有重要作用[3]， Babae等[17]发现移植后的AD小鼠动物模型海马区Aβ沉积的减少伴随着小胶质细胞的激活，小胶质细胞常常出现在Aβ沉积的附近，提示BMSCs在以小胶质细胞激活为主的炎症反应过程中扮演重要角色。早期时Malm等[24]等发现小胶质细胞通过分泌神经营养因子从而起到神经保护作用，此外它还通过吞噬作用消除脑内Aβ沉积。最近Naaldijk等[21]将BMSCs经小鼠尾静脉移植后，皮层的小胶质细胞数量、大小减少，检测到肿瘤坏死因子α，白介素-6、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1)和神经生长因子(Nerve growth factor， NGF)基因表达降低。另外，发现IL-10、趋化因子CCR5、BDNF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)的表达没有变化，海马区Aβ斑块体积缩小。此研究结果推测BMSCs移植可能通过对小胶质细胞激活的免疫调节作用改变AD的病理变化[21]。同时观察到BMSCs治疗后的小鼠皮层前列腺素E2受体(prostaglandin E2 receptor, PTGER2)表达减少，而在海马区则增加。标志着BMSCs调节脑内炎症及免疫作用的复杂性[21]。具体机制和原因还需要进一步的研究。PTGER2有神经毒性，早期研究Yang等[25]发现环氧合酶-2(cyclooxgenase 2，COX-2)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)可能参与IL-13诱导活化的小胶质细胞死亡，推测是神经炎症的消除和结局的一种内源性机制。

六、BMSCs的神经保护作用

早期研究发现BSMCs或其上层清液可以显著提高神经细胞的存活率和抑制细胞凋亡[26，27]。Hokari等[28]发现BMSCs可以旁分泌BDNF、VEGF、胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-β1等因子，推测神经因子作为胞外的分子信号进一步发挥修复神经元作用及调节BMSCs的分化。在AD神经元BDNF和磷酸化酪氨酸蛋白激酶B(phosphorylated tyrosine kinase B, pTrkB)减少，提示在AD神经元的Aβ过度产生可能会触发细胞死亡信号通路，部分是通过下调BDNF/TrkB信号通路中的TrkB而激活的[11]。其中BDNF是脑内最普遍的神经营养因子，对认知、学习和记忆的形成起着至关重要的作用，可促进神经再生和突触的形成，降低氧化应激和抑制细胞凋亡等[29]。Song等[11]检测到AD神经元突触损伤时，线粒体功能障碍和缺乏生长因子，如NGF、BDNF，致使神经元细胞活力和突触完整性下降，经移植BDNF修饰的BSMCs后，可以通过BSMCs对提供持续的BDNF并促进受损神经元和突触修复，增强BSMCs的治疗作用，逆转AD的病理改变，BSMCs表现出明显的神经保护作用。Zhang等[30]发现，Aβ25-35处理后在PC12细胞内瞬变轴突糖蛋白1 (transient axonal glycoprotein-1, TAG1)基因表达上调，Aβ前体蛋白(Amyloid β precursor protein, APP)和APP胞内剪切片段(APP intracellular domain, AICD)也上调，提示TAG1/APP/AICD途径在AD发展中起重要的作用，BSMCs可降低TAG1、AICD、p53、APP表达水平，并且降低凋亡相关蛋白Bax和升高抗凋亡因子Bcl-2的表达水平，降低半胱天冬酶3 (caspase 3)活性，半胱天冬酶是细胞凋亡中的重要分子，提示阻断AICD/p53/Bax/Caspase 3信号通路可以抑制细胞凋亡。BSMCs保护神经细胞抑制其凋亡作用，可能通过调控TAG1/APP/AICD信号通路有关[30]，此外Aβ降解酶依赖AICD通路[31]的调控。APP信号通路在AD病程发展中有重要作用，AICD可以成为治疗AD的新靶点[32]。

七、BMSCs与外泌体

外泌体为细胞分泌的膜状结构，可细胞膜融合后释放到胞外基质中，其功能是细胞间的信息交流载体，不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子，如mRNA和miRNA，以及功能蛋白，目前具体机制不明确，近年来成为研究热点[33]。BMSCs外泌体内还含有miR22、miR-1et-7a，这两者也参与相关免疫通路。这些特性提示BMSCs在临床上作为免疫调节剂应用，可促进神经元的生长和存活，其调节作用可能是通过旁分泌机制介导的，BMSCs分泌外泌体具有调节靶细胞RNA、mRNA、蛋白质和脂类的功能，对AD等神经退行性病变有潜在治疗作用[33-35]。 近期Lopez等[34]研究显示BMSCs来源的外泌体促进AD小鼠皮质神经元和感觉神经元的轴突生长。最近一项研究，Nakano等[36]在小鼠侧脑室注射BMSCs的外泌体，治疗后小鼠认知障碍得到改善，发现BMSCs及BMSCs来源的外泌体可抑制氧化应激和增加神经元突触密度，认为BMSCs来源的外泌体可以恢复种原因引起神经元和星形胶质细胞损伤，可能是BMSCs旁分泌机制介导的。

八、小结

AD患病率呈逐年上升趋势，严重威胁人们生活质量，给社会和家庭带来了沉重的负担。BMSCs治疗AD显示发展潜力和应用前景。随着研究机制逐渐明了，BMSCs 将在临床治疗AD等中枢神经系统疾病中发挥更大的作用。