常染色体隐性遗传性肢带型肌营养不良症研究进展

王明秋 肖兴军 朱冬梅

黑龙江省科学技术厅资助肢带型肌营养不良相关基因的克隆和功能研究(D2007-24)

单位名称：150081 黑龙江省哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科[王明秋 肖兴军(通信作者)]；中航工业哈尔滨242医院(朱冬梅)

常染色体隐性遗传性肢带型肌营养不良症研究进展

王明秋 肖兴军 朱冬梅

肢带型肌营养不良症(Limb girdle muscular dystrophy,LGMD)是目前第四大最常见的遗传性肌肉疾病，其发病率约为1/20 000[1],据统计LGMD2型的基因携带率为1/72[2]。其作为一大组肌肉疾病，根据遗传方式的不同可分为常染色体显性遗传性肢带型肌营养不良症(LGMD 1型)和常染色体隐性遗传性肢带型肌营养不良症(LGMD 2型),其中LGMD2型更为常见，占LGMD的90%，目前可分为25个亚型(2A～2Y)[3-5]。由于其临床表现和遗传模式具有高度异质性，二者之间的关系仍是世界范围内的一大难题。本研究就近几年其各种亚型及分子生物学等方面的研究进展做一综述。

1 LGMD2型分子生物学

目前，已有数百个LGMDs相关的基因变异作为致病基因而被报道，然而并非所有的基因变异都真正具有致病性，目前所报道的部分致病基因研究证据尚不充分，大多数情况下其致病性的确定通过他们未在健康对照组和/或在小家庭的隔离研究中出现来确定。为进一步明确LGMDs基因变异的致病性以及低频变异率，Giuseppina 等人通过在Leiden Open Variation Database (LOVD)和Human Gene Mutation Database (HGMD)这2个数据库中搜索所有LGMD2A-2P相关致病基因的变异，并在NHLBI GO Exome Sequencing Project(ESP)中搜索他们的变异频率，共获得85个LGMD2型相关的基因变异，其中有害变异59个，良性变异18个，致病性未明变异8个，并应用生物信息技术以及统计学方法，最终得出ESP中包括约9%的既往所报道LGMD2型的变异。此外，基于普通人群的LGMDs患病率(1∶20 000)，进一步得出LGMD2型的等位基因频率为0.0063，即所公认的疾病等位基因频率比所估计的疾病患病率要高，并指出确定基因变异的致病性，需进一步行复合杂合性分析以及功能验证。最终，研究者提出了一些疾病相关的变异是非致病性的，并且另有一部分基因变异虽然影响了蛋白的功能但仍不具有外显性，从而验证了LGMD2型这种异质性疾病有着更复杂的遗传机制。因此，实际中对于LGMD患者基因变异的错误分类将会给其家人的诊断带来极大的误导，确定LGMD各个基因变异的致病性至关重要[2]。

LGMD2型相关蛋白的致病作用机制各异。目前人们的研究重点已从识别结构蛋白以及其在肌营养不良进展中的意义转向研究蛋白在肌纤维重复损伤后的维护(dysferlin,、caveolin 3 和anoctamin 5)和应激条件下的纤维重塑(calpain 3)中的作用以及此过程中所涉及的蛋白与酶在翻译修饰中的意义(POMT1,POMT2,POMTGnT1)。尽管先进的分子生物学技术不断发展与应用，目前仍有部分蛋白的功能尚未确定[6]。LGMD2型中SGCG、SGCA、SGCB、SGCD(LGMD2C-2F统称为肌聚糖病)共同编码了肌聚糖复合物，编码的产物γ、α、β、δ-sarcoglycan共同组成1个跨肌膜的异四聚体，为连接细胞骨架和细胞外结构的跨膜蛋白，发挥稳定肌膜的作用；TRIM32 (LGMD2H)，Myotilin (LGMD1A)以及 DNAJB6 (LGMD1D) 三者均定位于肌节的Z盘，而Myotilin和DNAJB6均与蛋白聚集有关，TRIM32的功能至今尚未明确[7-8]。Desmin (LGMD2R和LGMD1E)是肌肉特异性参与蛋白聚集的中间丝蛋白家族成员之一；Plectin(LGMD2Q)是一种可与抗肌萎缩蛋白和β-肌营养不良蛋白聚糖相互作用的膜蛋白；Titin(LGMD2J)是一种巨型肌节蛋白(从Z线到M线跨越半个肌节，调节肌凝蛋白组装，作为粗肌丝末端到Z线之间的弹性连接蛋白)；POMT1 (LGMD2K)、 POMT2 (LGMD2N)、POMGnT1 (LGMD2O)和 FKTN (LGMD2M)分别编码了定位于内质网(POMT1 和 POMT2)以及高尔基体(POMGnT1 and FKTN)上的糖基转移酶，并参与细胞外基质中蛋白的糖基化，这些糖基化转移酶对细胞外基质细胞骨架的连接至关重要[7]。

LGMD2A作为世界范围内LGMD中最常见的亚型，其临床表现、致病基因、肌肉病理特点等方面已研究较透彻，该型由编码肌肉特异性钙激活中性蛋白酶-3(calpain-3，CAPN3)的基因突变引起，突变位点在染色体15q15.1～q21.1上。calpain-3并非骨架蛋白，这种酶存在胞浆及胞核中,它通过肌肉特异性的序列IS2与肌联蛋白(titin)相连，其功能可能与转录因子的调节有关[9]。目前为止，已有>500个突变位点被报道。Calpain是一种Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶，其分布于人体全身各处；钙激活蛋白酶家族中任何一个成员的功能缺失都将会导致不同的病变，例如胚胎致死、胃病、肌营养不良或血小板功能障碍。在人体基因组织中共发现15个钙激活蛋白酶家族成员(CAPN1-CAPN15)，其中CAPN3仅表达于骨骼肌中，且仅需要较低的钙离子浓度(生理状态下)便可激活。NCX3为钠钙交换体家族成员之一，也表达于骨骼肌的三联管中，且多项研究已证明其参与了肌质网中钙离子的回收。2016年Lauriane等人提出caipain-3为作用于肌肉的新靶点，CAPN3基因对肌肉有较强的敏感性，而该敏感性被认为仅由骨骼肌中NCX3-AC这一突变型产生；该种基因的直接裂解突变可导致CAPN1和 CAPN3的转换，进而干扰继发于兴奋收缩解耦联的肌质网中钙离子的释放以及与其他离子的转运，从而导致LGMD2A型疾病的发生。由此，CAPN3所介导的钠钙交换体NCX3的功能失调会导致诸如LGMD2A型等多种肌肉病变[10]。

2014年Ana Cotta等人研究报道发现，同一家族中的3例患者同为calpain-3基因突变，其中2例突变位点相同，但3例患者的肌肉病理均呈现为不同类型、不同程度的肌营养不良性改变。由此可见，LGMD基因型与表型之间的关系错综复杂，还有待于进一步研究[9]。

LGMD2C是最严重的亚型之一，多于儿童起病，其进展常比较迅速，多数患者在起病10年后丧失行走能力,并于29岁前死亡。2014年Samiah等人对4个西班牙无血缘关系家系中的4例LGMD2C患者的SGCG突变基因进行微卫星标记的遗传多态性分析，其中2例患者表现为儿童起病，但病程进展缓慢，于40岁左右丧失活动能力。在这4例患者中使用6种多态性微卫星标记物分别在SGCG基因的内部(D13S232)和两侧(D13S175,D13S292,D13S787,D13S1243,D13S283)进行标记，其中D13S232和D13S292两种标记物高度提示了4个家系的LGMD2C患者均为单倍体型的SGCG等位基因突变。有研究显示，SGCG基因的c.787G>A (p.E263K)位点的错义突变为西班牙LGMD2C患者中的一种原始基因突变，并且该种突变的患者可相对较长时间保留活动能力，且进展缓慢，并进一步证明了LGMD患者突变基因型的多态性[11]。

2015年Claudio Semplicini等人对25个LGMD2E型家系中的32例患者(16例男性和16例女性)进行临床表型、基因型、蛋白表达的回顾性分析，并从患者外周血或肌肉组织中提取基因组DNA进行单链构象多态性测序分析或直接测序分析，最终得出LGMD2E型患者SGCB基因突变谱，共发现了17个突变位点，其中有5个为新发现的突变位点即c.518_519insC、c.543C>G、c.754_957del、c.36_37delinsG、c.1A>G，并进一步扩展了LGMD2E的表型范围，由轻到重各不相同，因此仅依靠临床表现进行肌聚糖病(LGMD2C、2D、2E、2F)4个亚型之间的鉴别诊断是不可行的，只有通过对编码4种肌聚糖蛋白的基因进行分子生物学分析，才能准确地做出鉴别诊断。此外，还可通过SGCB基因突变类型以及肌聚糖蛋白的表达来预测患者临床症状的严重程度。报道统计，LGMD2E型患者中约50%以上伴有心肌受累，并且其可独立于肌无力在病程中的任何阶段出现，甚至出现在骨骼肌受累之前[12]。

LGMD2X最先发现于1个阿尔巴尼亚的家系中，共4例患者，该亚型是由6q21染色体上的编码POPDC1蛋白的基因突变所致，其突变位点为c.602C>T、p.S201F，POPDC1编码的BVES蛋白存在于细胞膜、肌纤维的T-小管以及核膜上，是一种环磷酸腺苷结合蛋白，可在骨骼肌和心肌细胞中表达，并参与上皮细胞间紧密连接的通透性屏障的形成与调控以及囊泡运输，并与小窝蛋白3(Caveolin-3)和TREK-1钾离子通道蛋白相互作用。临床上主要于30～50岁起病，表现为对称性近端肢体无力，可伴有心肌受累，主要表现为心源性晕厥以及房室传导阻滞；实验室检查主要为血清CK增高(700～8 000 U/L)肌肉病理可见肌纤维大小不一，核内移，肌纤维坏死与再生[4]。

LGMD2Y报道于1个土耳其家系中，共3例患者。该亚型是由1q25.2染色体上编码TOR1ATP1蛋白的LAP1B基因突变所致，即c.186delG位点的纯合子移码突变。LAP1B蛋白定位于核内膜，是一种A型和B型核纤层蛋白结合蛋白，可调节ATP酶的活性。临床起病年龄为10岁左右，主要表现为关节挛缩，主要表现为脊柱强直以及远端或近端的指间关节的挛缩，且主要为肢带肌的无力，目前只有1例患者被报道伴有心肌受累(扩张型心肌病)。实验室检查为血清CK可增高(80～500 U/L)，肌肉病理可见肌纤维大小不一，核内移，轻度的坏死，肌内膜结缔组织增多，蛋白印记可见TOR1AIP1蛋白的缺失，肌纤维的亚显微结构可见核膜异常改变[5]。

2 LGMD的基因治疗

关于LGMD治疗方面的进展大多数来自于动物模型试验中，常通过对可诱发疾病药物的逆转或者通过破坏缺陷基因下游中的某些步骤来获得。越来越多的证据表明CAPN3基因转移和应用基因突变的肌肉生长抑制素前肽是calpainopathy小鼠模型治疗的有效手段，然而肌肉中基因的持久性相对较差(9 d)，利用肌内的基因转移还不足以改善生活质量，并且用于评估改善程度的参数较难获得，例如收缩力，这需要在体外测得。因此，该治疗方法是否有效还有待于进一步研究。

据报道，一些新的治疗策略已试行于治疗DYSF基因缺陷性肌病中。最具特点的研究是Han等人提出补体成分C3的裂解可作为LGMD2B型的治疗靶点，但由于动物模型中肌肉收缩力测定的限制，其具体疗效还无法做以详细的评估。此外，其还提出膜攻击复合物(MAC)并不能作为治疗的靶点，因为在该研究中同时发现C5消融(1个MAC的通路终端组件)对疾病的影响很小。这个问题应该还需在未来的试验中利用炎症和非炎症模型进一步验证。此外，Lerario等人还提出利用淋巴细胞的灭减治疗方法来治疗dysferlin肌病(Dysferlin突变的3种类型如LGMD2B、Miyoshi肌病以及早期累及胫前肌群的肌病统称为dysferlin肌病)[13-14]。

在sarcoglycanopthies(肌聚糖蛋白病)患者中基因转移、干细胞移植、肌肉生长抑制素的阻断以及钙通道阻滞剂已在体内、外研究中应用。值得庆幸的是，肌聚糖蛋白病由于其基因较小，因此比其他类型的LGMD更容易取得基因治疗的成果。

尽管在动物模型试验中已经证明许多的治疗方法是安全有效的，但鉴于2个物种之间大小、寿命、遗传变异和免疫复杂性之间的明显差异，仍需谨慎这些治疗方法对于人类的适用性。

3 LGMD2型各个亚型之间鉴别诊断的重要性

LGMD诊断过程中除了注意与其他类型肌肉疾病鉴别外，近年来所提出的另一个重要并且具有挑战性的方面是LGMD各个亚型之间的鉴别，这对于遗传咨询、心肺疾病危险因素的评估、判断预后以及未来的靶向治疗的研究进展至关重要。其主要通过临床检查和肌肉MRI筛查出首先受累的具体肌群。此外，还需进一步评估肌营养不良的类型、肌肉组织活检形态学检查、免疫组化和蛋白印记以及基因检测[14]。

肌聚糖病(LGMD2C,LGMD2D,LGMD2E 和LGMD2F)、Telethonin蛋白病(LGMD2G)以及fukutin相关蛋白病(LGMD2I) 都具有较高的心肌病变的风险，其中LGMD2I患者可能在具有活动能力的疾病早期时便出现呼吸系统的受累[9]，而calpainopathy (LGMD2A)和dysferlinopathy (LGMD2B)型患者心肌受累的风险可与普通人群相似。LGMD2I和LGMD2K型患者中枢神经系统受累以及精神发育迟滞均较少出现[14]。LGMD2B和LGMD2G型患者的病程进展通常较缓慢；LGMD2A和LGMD2I型患者病程进展速度适中，而肌聚糖病(LGMD2C-2F)进展迅速[7]。

LGMD各个亚型肌肉的受累特点各不相同。据报道，LGMD2A和2I型患者的肌肉MRI显示为大腿后群肌肉的受累；LGMD2B和2G型患者主要为整个大腿肌群的受累；LGMD2C-2F型患者常为股四头肌受累，而无腓肠肌的受累[15]。LGMD2L型患者的肌肉MRI可表现为骨薄肌、缝匠肌、股二头肌短头以及胫骨前肌均受累[16]。由此可见，MRI检查有望在少部分LGMD患者中替代创伤性肌肉活检而直接进行相关基因检测[6]。

4 结束语

LGMD所包含的疾病谱系较广，随着新家系和缺陷基因的发现会对其不断修正和补充。近几年分子生物学领域的迅速发展为完善LGMD的诊断、分类、发病机制和治疗开辟了新的途径。然而，我们对LGMD各个亚型致病机制的认识还处于起步阶段，因此对于LGMD2型的研究还需进一步细化深入，这对于疾病的治疗、转归以及预后有着重要的意义[6]。

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R746.2

A

1007-0478(2017)05-0481-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.029

(2016-10-23收稿)