恶性黑色素瘤靶向治疗的研究进展

赵莉娟 邓辰亮 杨松林

恶性黑色素瘤靶向治疗的研究进展

赵莉娟 邓辰亮 杨松林

恶性黑色素瘤是皮肤黑色素细胞来源的高度恶性肿瘤，发病机制尚未清楚，黑色素细胞痣恶变、紫外线照射、病毒感染等多种因素均与其发生有密切关系。由于其具有转移早、病情隐匿的特点，早诊断、早治疗是恶性黑色素瘤治愈的关键。当前各种靶向治疗在抗肿瘤领域中发挥重要作用，如嵌合抗原抗体及携带药物的重组外泌体与恶性黑色素瘤细胞的靶向结合，已在体外实验中取得了显著效果。现综合国内外文献，就嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T）和外泌体用于治疗恶性黑色素瘤的进展综述如下。

恶性黑色素瘤；靶向治疗；嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T）；人内源性逆转录病毒K包膜蛋白（HERV-K）；外泌体

恶性黑色素瘤（malignant melanoma）是起源于胚胎期神经嵴的恶性肿瘤，其恶性度极高，预后较差。可发生于皮肤、眼球、消化道、生殖系统等部位，但其中以皮肤恶性黑色素瘤最常见[1]。由于恶性黑色素瘤恶性度高，易于早期转移，即使早期进行根治手术，患者5年生存率也低于70%[2]。免疫靶向治疗与传统化学疗法相比优势明显，因而日益成为治疗恶性肿瘤的新方向。嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptors T cell,CAR-T）是免疫靶向治疗药的代表之一，也是当前过继性细胞治疗技术中的一项新成果，因其能表达人工合成受体并能特异性识别靶细胞，正成为振奋人心的肿瘤治疗技术[3]。据报道，CD19特异性CAR-T已在B细胞白血病及淋巴瘤的临床试验中取得了明显疗效[4-5]，其治疗其他肿瘤的效果正进行临床预试验。国外实验报道，经人工改造的外泌体及恶性黑色素瘤表面发现的人内源性逆转录病毒K（human endogenous retrovirus,HERV-K）包膜蛋白可为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的临床思路[6]。

1 CAR-T在恶性黑色素瘤中的应用

1.1 CAR-T 嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors,CAR）是一种重组抗原受体，具有结合抗原并激活T细胞的功能。至目前为止，CAR已有3代设计模型。1991年有3个实验室首次报道了CAR的设计[7]，第1代CAR不含共刺激分子，只能引起T细胞的短暂增殖和低水平的细胞因子分泌，虽不能提供T细胞持续的抗肿瘤作用，但可使T细胞不依赖于主要组织相容性复合体（major histocompatibilitycomplex,MHC）-I类分子识别靶细胞。随后Smith-Garvin等[8]构造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的2代CAR，在临床前模型中发现4-1BB对CAR的功效更有益[9]。最近Long等[10]发现CD28信号是产生有效的临床T细胞制品的关键，而4-1BB可提高CAR的细胞持久性，于是结合2个共刺激分子设计出了第3代CAR。CAR-T是将抗体的抗原结合部与CD3-δ链在体外偶联成一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，T细胞经“重编码”后，可生成大量的肿瘤特异性CAR-T。CAR-T的大体治疗过程分为4步：⑴抽取患者外周血，并分离提取出免疫T细胞；⑵通过基因工程给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞并能同时激活T细胞的嵌合抗体，生成CAR-T；⑶体外培养，大量扩增CAR-T细胞；⑷将扩增好的CAR-T回输到患者体内。整个“提取——修饰——扩增”过程大约需要2周。与传统的T细胞识别抗原相比，经CAR识别抗原不受MHC的限制，同时第2、3代CAR可通过共刺激分子信号加强T细胞的抗肿瘤效果。

1.2 CAR-T靶向治疗恶性黑色素瘤 为了早期诊断恶性黑色素瘤，学者们在寻求免疫标志物方面做出了许多努力。有学者采用免疫组化检测S-100、HMB-45、Tyrosinasa等多种标志物在恶性黑色素瘤及良性痣中的表达[11]，发现这些标志物在敏感性及特异性上都存在不足之处，更难以成为免疫治疗的靶向。人内源性逆转录病毒K（human endogenous retroviruses-K,HERV-K）包膜蛋白是多种肿瘤细胞表面的相关性抗原[6,12-17]，包括乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤等，其在正常细胞表面均不表达。HERV-K与恶性黑色素瘤的早期转移潜能呈正相关性，Krishnamurthy等[6]利用HERV-K的肿瘤特异性，于T细胞表面设计相关CAR，发现CAR-T可特异性识别HERV-K并与其结合，发挥抗肿瘤作用。恶性黑色素瘤早期即可通过血液转移，传统的手术切除、化学疗法、放射疗法的效果不佳，预临床试验数据显示，嵌合HERV-K受体的T细胞（CAR-T）可准确作用于表达HERV-K的肿瘤细胞表面，并杀伤肿瘤细胞。由于HERV-K在正常细胞表面无表达，其特异性表达于HIV、白血病及多种肿瘤细胞表面，因此，嵌合HERV-K受体的T细胞可用于多种肿瘤的治疗。

此外，黑色素瘤细胞分化的抗原糖蛋白（glycoprotein,gp）100有较强的免疫原性，并在恶性黑色素瘤中过度表达，可作为恶性黑色素瘤靶向治疗的靶点之一[18]。Johnson等[19]将对gp100有特异性反应的T细胞分离后，将T细胞抗原受体转染给恶性黑色素瘤患者的淋巴细胞，结果发现19%患者的肿瘤体积发生减小。有学者将GPA7作为胞外区，结合T细胞的胞内区设计出CAR-T细胞，经转染后的T细胞能特异性识别恶性黑色素瘤表面的gp100[20]。随后将等量的CAR-T细胞与普通T细胞分别注射到恶性黑色素瘤小鼠模型中，结果发现注射CAR-T细胞小鼠的肿瘤体积比注射普通T细胞小鼠的肿瘤体积明显缩小。黏附分子L1-CAM在多种实体瘤，如恶性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有过度表达，有学者依据这类细胞表面标志物特性设计相应的CAR-T，在试验中取得了明显的抗肿瘤效果[21]。

理论上靶向抗原应该是特异性表达于恶性黑色素瘤细胞表面，在正常细胞和组织表面不表达，但实际上这种特异性靶向抗原非常少。例如Gp100、S-100、HMB-45、Tyrosinasa等在良性痣及白癜风组织中均有表达，如果基于类似抗原设计CAR-T，很可能对正常组织产生攻击作用，即脱靶效应。HERV-K虽在多种实体瘤表面均有表达，但在正常细胞组织无表达，是目前治疗恶性黑色素瘤最为理想的靶点。

2 外泌体在恶性黑色素瘤中的应用

外泌体作为一种可以包裹药物的载体，近年来也被用于肿瘤的靶向治疗。外泌体是经细胞分泌产生的一种自然产物[22]，它具有低免疫原性、无毒副作用[23]；且来源广，具有磷脂双分子层结构，易于与靶细胞的细胞膜融合[24]；分子结构小，分子量为纳米级（10～100 nm），可避免单核细胞的吐噬作用，且易于穿透肿瘤组织毛细血管向深层组织浸润[25]。现有试验发现，由内皮细胞及干细胞分泌的外泌体作为抗肿瘤药物的载体，其优势明显、不良反应小[26]。经未成熟树突状细胞（imDCs） 分泌的外泌体因缺乏 CD40、CD86、MHC-I、MHC-II等表面标志物[26]，免疫原性低，且imDCs-外泌体表面表达糖蛋白（Lamp2b），这种表面蛋白融合了iRGD靶向蛋白，可特异性识别肿瘤细胞表面的αⅤ整合素。目前，临床上许多抗肿瘤药物因剂量依赖性而应用受限，如阿霉素对多种肿瘤均有抑制作用，但因其对心血管具有剂量依赖性而限制其应用[27]。剂量依赖性产生的原因主要是药物缺乏特异性作用于肿瘤细胞的载体，而广泛作用于正常细胞引起。利用外泌体的靶向结合作用，可以将阿霉素等药物直接作用于肿瘤细胞，从而减少对正常细胞造成的损伤。通过基因转染技术过表达iRGD就可以得到大量携带iRGD的外泌体。基于这一原理，Tian等[26]设计小鼠模型，将阿霉素整合到imDCs-外泌体中，发现融合iRGD靶向蛋白的外泌体能特异性作用于表达αⅤ整合素的乳腺肿瘤细胞，使外泌体通过胞吐释放阿霉素，在体内充分发挥抗肿瘤作用，并且通过切片观察发现，并未损伤小鼠正常组织。还有实验发现，融合iRGD靶向蛋白的外泌体对αⅤ整合素具有高度的特异性识别与亲和力，在小鼠的乳腺癌模型中发挥显著的靶向治疗作用[27]。iRGD靶向蛋白不仅可以直接结合肿瘤细胞表面的αⅤ整合素，还可以促使抗肿瘤药物向肿瘤组织血管内渗透[28]。αⅤ整合素在多种肿瘤细胞表面均有表达，其中恶性黑色素瘤细胞表面也特异性表达这类整合素，虽然目前无实验验证外泌体作为药物载体治疗恶性黑色素瘤的有效性，但是，小鼠的乳腺癌模型为外泌体治疗恶性黑色素瘤提供了临床思路。

3 展望

恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高的皮肤肿瘤，发生转移后很难通过传统治疗得到有效的治疗效果，继手术、化学治疗、放射治疗手段后，免疫治疗日益成为研究热点。目前恶性黑色素瘤靶向治疗的瓶颈在于尚未发现理想的靶向标志物， HERV-K这类细胞表面标志物存在于多种实体瘤表面，特异性相对较差，现国内外学者正积极寻找恶性黑色素瘤的特异性抗原，相信这一新突破将为恶性黑色素瘤患者带来福祉。

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2016-07-24）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.017.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.017

上海交通大学附属第六人民医院 整形外科，上海 200233

杨松林,Email:yangsonglin1961@vip.qq.com

本文引用格式：赵莉娟，邓辰亮，杨松林.恶性黑色素瘤靶向治疗的研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2017,28(1):57-59.