RDP相同NFC及硫水平不同的日粮对人工奶牛瘤胃发酵影响

2017-01-09黄国欣刘大森杜江华李桂森

饲料工业 2017年7期

■黄国欣刘大森杜江华李桂森王赛郑帅

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

粗蛋白(CP)是反刍动物的重要营养物质之一,主要包括瘤胃降解蛋白(RDP)和过瘤胃蛋白(NFC)。其中瘤胃降解蛋白有利于瘤胃微生物的生长，而微生物为动物提供所需蛋白质的70%～80%[1]，同时微生物的增加也有利于饲料的消化与吸收，但是瘤胃降解蛋白过多会导致瘤胃氨产生量过高[2]，过多的氨通过肝脏的转化生成尿氮(N)，造成了蛋白质的浪费甚至会导致动物氨中毒。非结构性碳水化合物(如谷物和糖蜜)通常作为反刍动物的高能量饲料。非结构性碳水化合物在瘤胃的发酵过程中快速地转化成丙酸，丙酸是糖异生作用的重要前提物质[3]。非结构性碳水化合物影响着瘤胃的发酵，如降低原虫的数量、pH值和饲料的消化率，甚至会影响动物的采食量[4]。瘤胃能氮同步释放概念是根据瘤胃微生物的生长特性，通过对日粮中能量载体物质和含氮物质等同步化因子的调控，使其在瘤胃的发酵降解过程中物质形式总量和释放速度上相互匹配，促进微生物生长和瘤胃发酵的过程[5-6]。因此NFC和RDP的比例对瘤胃发酵的影响显得尤为重要[7]。在试验中发现，当饲料中含有约10%～13%RDP和56%的NFC时，瘤胃中的微生物粗蛋白(MCP)含量高，然而当NFC∶RDP的比为2∶1时，微生物粗蛋白含量最高[8]，此外，NFC与RDP适当的比例可以有效地提高氮的生物利用率[9-10]。

硫(S)是反刍动物所必需的矿物元素之一，在动物体内约占动物体重的0.25%，广泛存在于含硫氨基酸、维生素、肝素、纤维蛋白原、辅酶A及谷胱甘肽中，同时动物的蹄爪、被毛、角等各种角质蛋白质中也含有。硫在反刍动物体内起着重要的生理作用，对提高反刍动物生产力具有十分重要的意义。硫能够影响瘤胃微生物的合成[11-12]以及纤维素的消化[12]。增加硫的含量会降低甲烷的排量[13]与干物质采食量[14]，影响瘤胃的发酵。NRC(1981)建议S与N的比为1∶10，而N的来源主要是RDP提供的，因此我们猜想NFC/RDP与硫含量之间也会有相互作用共同影响瘤胃内环境，本试验设计研究的总体目标是在满足动物营养需要量的前提下，按照NRC营养标准，通过人工瘤胃体外培养瘤胃液的方法探究不同NFC/RDP及硫水平对瘤胃发酵内环境、主要发酵指标和菌体蛋白合成量的影响。从而揭示能氮同步释放和硫之间的相互作用关系及对瘤胃发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选择3只健康无病、体重相近，且装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛用于提取瘤胃液。瘘管牛的饲料按照NRC奶牛营养标准配制，日喂两次（07:00和19:00）先喂草料，后投精料，精粗比为45∶55，自由饮水，每日清晨清除剩料，并更换清洁饮水，清理牛舍，维持牛舍的干燥卫生清洁。

1.2 试验设计

本试验以短期人工瘤胃法模拟瘤胃发酵的方法进行体外试验。试验的饲料原料采用尼龙袋法测定出原料中RDP与NFC的含量，并根据饲料原料中RDP与NFC含量的不同设计3种日粮中总的能量和蛋白相同，RDP含量相同，NFC含量不同，NFC/RDP分别为3.35、4、4.8，并向每一种日粮配方中添加硫酸钠使3种日粮中的硫浓度分别达到0.15%、0.2%、0.25%和0.3%。形成3×4双因素完全随机分组试验，具体试验设计分组见表1。每组日粮取少量制成风干样，粉碎过40目筛供体外发酵试验使用。

1.3 体外发酵试验

1.3.1 瘤胃液的采集与发酵液的制备

瘤胃液采集与混合发酵液制备，晨饲前从3头已选好的荷斯坦奶牛瘤胃中采集瘤胃液，混合均匀后，通过4层纱布过滤，装于充满CO2的保温瓶中保存，在最短时间内带回实验室，39℃水浴备用。人工唾液参照隋美霞[14]方法配制，加入1%刃天青数滴为指示剂，并向配制好的人工唾液中通入CO2直至溶液颜色由蓝色变为无色即为氧气除净。然后按人工唾液与瘤胃液为2∶1的比例制备混合发酵液备用。

表1 日粮组成及营养水平(风干基础)

1.3.2 试验方法和测定指标

试验共分12个处理组，每个处理组设3个重复，每个发酵瓶中加入0.6 g日粮和60 ml发酵液。发酵瓶口用橡皮塞密闭，使用三通气阀与注射器相连。发酵瓶置于39℃水浴摇床中以40 r/min的速度振荡。培养瓶分别在2、4、8、12、24 h后取出，立即用pH计测定pH值，3 500 r/min离心15 min,沉淀用于测定饲料干物质的降解率(DMD)，取上清液-20℃冷冻保存用于测定氨态氮（NH3-N）、VFA、菌体蛋白的含量。

1.3.3 数据的测定方法

产气量直接从注射器上就可读出，采用Sartorius-PB-20型酸度计测pH值；NH3-N采用冯宗慈[15]的方法进行测定；菌体蛋白含量参考Askar等[16]方法测定；干物质用烘干称重法测定，挥发性脂肪酸参照秦为琳[17]的方法采用气相色谱柱进行测定。

1.4 数据处理与统计分析

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件初步整理，结果处理采用SAS进行双因素分析，方差分析和多重比较，以P＜0.05为差异显著。

2 试验结果

2.1 pH值（见表2）

由表2可知，NFC/RDP对pH值影响除2 h外均显著(P＜0.05)，NFC/RDP为4的处理组pH值显著高于NFC/RDP为4.8的处理组(P＜0.05)。硫水平在4 h时对pH值影响不显著（P＞0.05），其余时间点影响显著。在各时间NFC/RDP的比值和硫水平之间均存在交互作用。

2.2 产气量（见表3）

表2 NFC/RDP及硫水平对瘤胃pH值的影响

表3 NFC/RDP及硫水平对产气量的影响（ml）

如表3所示，不同处理组底物发酵产气量随时间的动态变化情况。各处理组的底物发酵的产气量均随时间延长而增加。NFC/RDP水平对产气量影响显著（P＜0.05），NFC/RDP为4的处理组各时间点的产气量均显著高于其他两水平（P＜0.05）。硫水平对处理的产气量影响显著（P＜0.05），硫水平为0.25%的处理组显著高于其他处理组（P＜0.05）。除8 h外，NFC/RDP和硫水平对产气量均存在交互效应。

2.3 NH3-N（见表4）

表4 NFC/RDP及硫水平对瘤胃NH3-N的影响(mg/100 ml)

由表4可见，NFC/RDP比值在8、12 h和24 h时各处理组的NH3-N浓度影响显著(P＜0.05)，且NFC/RDP比值为4的处理组显著低于NFC/RDP水平为3.35的处理组。硫水平在2、4 h和8 h时对各处理组的NH3-N浓度影响不显著（P＞0.05）；硫水平在12 h和24 h对各处理组的NH3-N浓度影响显著(P＜0.05)，且NH3-N浓度随着硫添加量的增加而降低。NFC/RDP和硫水平对NH3-N浓度存在交互作用。

2.4 菌体蛋白（见表5）

如表5所示，各处理组的菌体蛋白浓度随时间的延长而增加。NFC/RDP对各处理的菌体蛋白含量影响差异显著(P＜0.05)，NFC/RDP为4的处理组MCP含量显著高于3.35的处理组(P＜0.05)，各NFC/RDP水平的处理组MCP含量由高到低依次为4＞4.8＞3.35。硫水平对各处理组MCP含量影响差异显著(P＜0.05)。硫水平为0.25%的处理组的MCP含量最高。NFC/RDP和硫水平在各个时间点对MCP浓度均不存在交互作用。

2.5 饲料干物质降解率（见表6）

由表6可以看出，随时间的延长，各处理组的DM降解率不断增加。NFC/RDP在12 h时对DM降解率影响不显著（P＞0.05），其他时间点影响均显著(P＜0.05)。NFC/RDP水平为4时，DMD略高于其他时间点。不同硫水平在各时间点对DM降解率的影响差异均为显著(P＜0.05)。硫水平为0.25%的处理组在各时间点DM的降解率均高于其他各组。各时间点的NFC/RDP和硫水平之间存在交互作用。

2.6 NFC/RDP和硫水平对瘤胃VFA含量的影响（见表7、表8、表9）

表5 NFC/RDP及硫水平对瘤胃菌体蛋白浓度的影响(mg/100 ml)

表6 NFC/RDP及硫水平对瘤胃DM降解率的影响(%)

表7 NFC/RDP及硫水平对瘤胃乙酸的影响(mmol/l)

由表7可知，各处理组底物发酵产生的乙酸均随时间的延长而增加。除24 h外，NFC/RDP对各处理组乙酸含量影响显著(P＜0.05)，NFC/RDP水平为3.35的处理组的乙酸浓度显著高于其他两处理组(P＜0.05)，不同硫水平之间仅在4 h时存在差异（P＞0.05），硫水平在其他时间点对乙酸浓度影响不显著。NFC/RDP与硫水平在8 h时存在交互作用。

如表8所示，各处理组的丙酸浓度随时间的延长而增加。在各时间点NFC/RDP水平丙酸浓度影响显著，NFC/RDP水平为4.8的处理组丙酸浓度最高。硫水平对相同时间点的各处理组丙酸浓度影响显著(P＜0.05)，丙酸浓度随底物含硫量的提高而升高，但硫含量为0.3%时略有下降。除2 h外，NFC/RDP和硫水平在各时间均存在交互作用。

表8 NFC/RDP及硫水平对瘤胃丙酸的影响(mmol/l)

表9 NFC/RDP及硫水平对瘤胃丁酸的影响(mmol/l)

表9列出了不同NFC/RDP和硫水平对不同处理组的丁酸浓度动态变化的影响。NFC/RDP水平对各处理组丁酸浓度在各时间点影响差异显著(P＜0.05)，NFC/RDP水平为4.8的处理组丁酸水平显著高于NFC/RDP水平为4的处理组(P＜0.05)，除2 h外，其他时间点3.35的处理组丁酸水平显著高于NFC/RDP水平为4的处理组(P＜0.05)。硫水平对丁酸浓度影响显著(P＜0.05)，硫水平为0.25%的处理组的丁酸浓度显著高于其他各组(P＜0.05)。NFC/RDP水平和硫水平在各时间点均存在交互作用。

3 讨论

pH值是瘤胃发酵的一个重要指标。在这个试验中，pH值变化从6.5到6.75，适合纤维素的消化[18]。随着NFC供给的不同，pH值的变化与Broderick[19]试验结果相一致；此外，pH值也随S浓度增加而提高，但是这与Weston[20]的结果不一致，Qi[21]没有发现硫浓度和pH值之间的关系。这种的结果不一致可能是由于试验动物不同，导致动物所提供的用于做人工瘤胃发酵的瘤胃液也不同。

NH3-N是反映了饲料氮源在瘤胃中的降解以及微生物对氮源的利用情况的重要指标，12 h之后随着硫浓度的增加瘤胃内NH3-N的含量降低，这与Siebert[22]和Elliott[23]的试验结果一致。在NFC的水平,在8 h之后才有差异，其原因可能是，虽然各处理组NFC含量不同，但是前8 h时日粮中RDP水平和NFC均可满足微生物的需要，然而随着微生物的继续发酵，虽然RDP还有剩余，但是由于各实验组的NFC含量的不同，致使NH3-N的利用率也不相同，各处理组之间由此出现差异。

瘤胃内MCP的合成主要取决于瘤胃内碳水化合物和N的利用效率，瘤胃微生物活性受到NFC与RDP比例的影响。当比值为4时MCP产量最高这与[7]试验结果一致。硫对菌体蛋白的影响也显著，当硫水平从0.15%到0.25%不等，MCP的含量逐渐上升[24]，但是当硫水平提高到0.3%的浓度时菌体蛋白又有所下降，说明过量的硫抑制了瘤胃微生物的生长。

瘤胃中VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是碳水化合物在瘤胃中发酵的主要产物。乙酸是反刍动物合成乳脂的主要前体，丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体，因此提高乙酸在VFA中的比例可以提高奶牛的产奶性能，而提高丙酸含量则有利于反刍动物的育肥。碳水化合物成为VFA的主要原因影响因素,随着NFC的增加乙酸和丙酸的含量也随之增加，当硫浓度从0.15%提高到0.25%时，发现丙酸和丁酸浓度逐渐增加，然而乙酸浓度降低，这个结果与Zinn[25]一致。但是在硫水平为0.3%时略有下降。硫水平对乙酸的影响与张桂国的结果基本一致。

本试验中不同NFC/RDP水平的各处理组的产气量由大到小依次为4＞4.8＞3.35，说明能氮同步化释放对瘤胃发酵影响显著，其中当NFC/RDP为4时饲料的消化程度最高，但与汤少勋[26]的研究结果有差异。添加硫能显著提高产气量，但是当硫为0.3%时对产气量又有抑制作用。本试验中NFC/RDP水平和硫水平对各处理组的瘤胃发酵产气量的影响变化情况与各处理组DM降解情况基本一致，与Tuah[27]的研究结果基本一致。

当RDP相同时，本试验中不同NFC/RDP对DM降解率的影响显著（12 h除外），除4 h外，其它各时间点NFC/RDP水平为4时DMD数值上均高于其它各处理组，这与赵永生[28]的结果有一致性。试验中，DM的降解率随着硫水平的提高而增加，但当硫含量达到0.3%时，DM的降解率出现显著下降。硫水平对DM降解率的影响结果与王娜[29]和王润莲等[30]研究结果基本一致。