芒萁组织培养和快繁技术研究

杨春梅 ，屈云慧，汪国鲜，单芹丽，吴丽芳，阮继伟，蒋海玉

(1.云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 653200 ；3.云南省农业科学院农业经济信息研究所，云南 昆明 650205)

芒萁组织培养和快繁技术研究

杨春梅1，2，屈云慧1*，汪国鲜1，2，单芹丽1，2，吴丽芳1，2，阮继伟1，2，蒋海玉3**

(1.云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 653200 ；3.云南省农业科学院农业经济信息研究所，云南 昆明 650205)

以孢子为外植体对芒萁进行组织培养。在基本培养基中添加不同生长调节物质对孢子萌发和孢子体进行诱导。结果表明，孢子体萌发阶段最适培养基组合是1/2MS培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH值 5.8～6.0；原叶体增殖阶段，最佳培养基组合为1/2MS + NAA 1.0 mg/L +6-BA 1.5 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L；孢子体的诱导最适培养基组合是1/2MS培养基+ NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L +琼脂7 g/L。

芒萁；组织培养；快繁技术；孢子体诱导:

蕨类植物是观叶植物中最具特色的一群，素有“无花之美”的称号，其株、叶、根、茎、芽、孢子囊群均可观赏[1]，可做盆景、切花配叶及园林绿化[2-3]。

芒萁[Dicranopterisdichotoma]又称铁狼萁，为里白科(Gleicheniaceae)芒萁属(DicranopterisBernh.)多年生蕨类植物[4-5]。除可供观赏外，其地上部分及根状茎均可入药，具有清热利尿、解毒消肿、化瘀止血的功效[6]。芒萁植物耐旱、耐瘠薄，地下茎纵横交错，深入土层3 m以上，可栽培治理水土流失[7]。由此可见，芒萁具有广阔的应用前景。

芒萁的繁殖有孢子自然繁殖、营养繁殖和组培快繁。孢子自然繁殖，生长地域受限，加之近年来自然环境的破坏，孢子自然繁殖很难满足人们的需要；营养繁殖包括根状茎、株芽、肥厚的叶耳等营养器官进行繁殖。营养繁殖周期长、系数低；组织培养繁殖，只需采集少量孢子或一小部分营养器官，就能培育出大量的幼苗，具有所需原材料少、繁殖系数大的特点，是种苗的有效途径[8-9]。但芒萁组织培养和快繁技术尚未见报道。

正交试验不仅可以大大减少工作量，而且还可通过对正交试验结果进行科学的极差分析和方差分析，得到最优组合，这在植物组织培养中有着重要的应用价值[10]。本试验以孢子为外植体对芒萁进行组织培养，建立快繁体系，为芒萁资源更好地利用提供理论参考。

表1 原叶体增殖阶段的L9 (34)因素水平

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试芒萁，取自云南省农科院花卉所九溪盆花试验基地。

试验于2013年5-11月在云南省农科院花卉研究所组培中心(玉溪基地)进行。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子的收集、消毒 ①孢子的收集：将成熟的孢子连同叶片自植物体上一起剪下，放入洁净的硫酸纸内，放在通风的地方，15 d左右孢子散落，收集成熟的孢子，置于4 ℃冰箱中保存，供培养使用 。 ②孢子的消毒：在超净工作台上，用75 %酒精消毒25～30 s左右，无菌水冲 3～4 次；再用 0.1 %升汞消毒4～5 min，无菌水冲 4～5次,备用。

1.2.2 孢子萌发 以MS、1/2MS 、1/3MS、KnopS 为基本培养基，添加琼脂7 g/L 、蔗糖30 g/L，pH值5.8，培养温度(28±2) ℃， 日光灯光源，光照强度为1000～1500 lx，光照时时间为12 h/d培养，培养40 d，观察统计孢子萌发情况。

每处理5瓶，每瓶接种孢子60个，重复3次。

1.2.3 原叶体增殖培养 将萌发成的原叶体分散成小块，每块约0.5 cm×0.5 cm，含3～5片原叶体，接种到原叶体增殖培养基上以1/2MS 、1/3MS、KnopS 为基本培养基，分别加入不同质量浓度的NAA、6-BA、蔗糖，按正交设计表4因素3水平L9(34)正交试验设计(表1)，进行原叶体增殖培养，培养40 d，观察统计原叶体增殖情况[原叶体增殖率( %)=(40 d后的鲜重/最初的鲜重)×100 %]，每个处理为3瓶，每瓶接种原叶体堆(直径3～5 mm) 5个，重复2次，记录原叶体的质量。

1.2.4 孢子体诱导 将原叶体分割成1 cm×1 cm大小，接种在1/2MS+不同浓度NAA 0、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L的培养基中，每瓶接种5个原叶体，每处理5瓶，重复3次。60 d后观察孢子体诱导率。

1.2.5 炼苗与移栽 将置于室温下放置3～4 d，去盖，从培养瓶中取出，移栽至腐殖土中，遮阴。试管生根组培苗3～5 cm高时用镊子从培养瓶取出，清洗掉培养基，尽量避免不要伤根，移植到消毒过的泥炭为基质的穴盘中，放人大棚，管理条件：温度20～ 25 ℃，光强500 lx，遮阴率60 % ，湿度保持在90 %左右，移栽后30 d，成活率可达90 %以上。

1.2.6 培养条件培养室条件 白天温度25 ℃，夜间21 ℃，散射光，光强300 lx，光照时间12 h/d，湿度80 %。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对芒萁孢子萌发的影响

从表2可以看出，5种无机盐不同质量浓度的培养基对芒萁孢子萌发都有影响，萌发率在39.8 %～69.7 %。孢子萌发率最高的是1/2MS，达69.7 %； 孢子萌发率最低的是MS培养基，为39.8 %。方差分析结果表明，1/2MS培养基、1/3MS培养基和Knop’s低盐培养基对孢子的萌发率差异不显著，说明这3种培养基对芒萁孢子萌发率的影响无差异；MS培养基与其它3种培养基相比，孢子的萌发率差异达极显著。表明孢子的萌发与无机盐的质量浓度有关，降低培养基中无机盐的质量浓度可促进孢子萌发。

表2 不同培养基对孢子萌发的影响

注：同列肩标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05);同列肩标大写字母不同者表示差异极显著(P<0.01)。 Notes:Data followed by different small letters were significantly different at the 0.05 level; Data followed by different capatal letters were significantly different at the 0.01 level.

表3 叶原体增殖试验结果

注：Ki代表水平i的平均值；*表示差异达0.05显著水平(F0.05=4.46)。下同。

Notes:Kimeant the average of leveli; *meant 0.05 significant level(F0.05=4.46). The same as below.

2.2 原叶体增殖培养

由表3的分析表明, 4种因子对芒萁原叶体增殖效应的大小依次是培养基>6-BA>蔗糖>NAA。在直观分析的基础上对芒萁原叶体增殖进行方差分析，结果(表5)表明，除基本培养基对芒萁原叶体增殖的影响没达到显著水平外，其余 NAA、6-BA、蔗糖3个因素均对芒萁原叶体增殖的影响均达到显著水平(P<0.05)。以上分析结合表3可知，对芒萁原叶体增殖的影响最佳组合为A2B3C1D3,即1/2MS + NAA 1.0mg/L +6-BA 1.5mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂 7 g/L，增殖系数为5.95。

2.3 不同培养基对孢子体诱导的影响

由表4可以看出，将叶原体接种在1/2MS+不同质量浓度NAA培养基中，均可诱导孢子体形成，诱导率25.8 %～91.1 %。诱导率最高是NAA 0.1 mg/L，诱导率91.1 %；最低的是NAA 0.3 mg/L，诱导率25.8 %。经方差分析表明，NAA 0.05 mg/L、和NAA 0.1 mg/L对孢体子的萌发率差异不显著。表明高浓度的NAA对芒萁孢子体诱导有抑制作用。

3 讨 论

芒萁的组培快繁除利用孢子外，还可以利用植株体上的根状茎、嫩叶、叶柄等作外植体。本研究以孢子为外植体进行组培快繁，实际上是将蕨类自然繁殖转换到人工可控的环境中进行繁殖，具有取材容易、不损害母株、容易消毒、繁殖系数高等优点[11]，是芒萁组织培养的有效方法。

表4 不同培养基对孢子体诱导的影响

蕨类孢子萌发使用有多种基本培养基。Wang HsinMei，陈龙清以MS为基本培养基诱导孢子萌发[12-13]； Hirch AM[15]和Teng WT[16]研究表明高盐浓度的基本培养基会抑制某些蕨类孢子的萌发，与笔者研究结果一致。

Kwa等[15]认为凤尾蕨的原叶体在1/2 MS上只能增殖，只有在1/10MS上才能诱导形成孢子体。笔者采用1/2 MS， 同样获得孢子体，这可能是芒萁对于大量元素不敏感造成的。

蔗糖在组织培养中一个作用是解决培养基的渗透压问题[14]，另一个作用是对世代转换起重要调控作用[18]。程治英等[19]研究认为，原叶体的分化需要糖的参与，但浓度不宜高，否则影响孢子体的生长。本试验通过正交试验，得30 g/L蔗糖有利于叶原体的增殖，与田晓艳等[14]的报道一致。

[1]岳 锋，樊智丰，杨 斌.云南省主要观赏蕨类植物资源及其园林应用[J].北方园艺，2010(11)：90-94.

[2]梁 芳，王文哲.浅谈观赏蕨类的开发利用研究[J].园林园艺，2014，3l(7)：166-267.

[3]黎建玲, 黄肇宇, 叶晓霞,等. 都峤柚谷风景区野生经济植物资源调查[J]. 南方农业学报, 2014,45(3):447-452.

[4]周玉雷, 赵旭东, 袁树先,等. 芒萁对几种豆科植物种子萌发的影响[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(8):120-122.

[5]秦仁昌.中国蕨类植物科属的系统排列和历史来源[J].植物分类学报，1978，16(3)：1-19.

[6]梁晓华，徐成东，张纯灏，等.云南17种蕨类植物总蒽醌的测定[J].大理学院学报，2008(7)：8-10.

[7]林夏馨. 芒萁的生长发育规律及人工繁殖技术[J].福建水土保持，2004，16(2)：60-62.

[8]李 柯，王力超.观赏蕨类植物的繁殖技术[J].南方农业(园林花卉版)，2008,2(4)：76-78.

[9]吴繁花，张 超,周亚东，等. 中国观赏蕨类植物的种类、繁殖方法及在园林中的应用[J].热带生物学报，2012，3(4)：387-391.

[10]赵 钢，杨小萍，袁 畅，等. 优化甜荞的愈伤组织诱导研究[J].西南农业学报，2012，5(4):1525-1527.

[11]尹铁龙，孙平平.蕨类植物组织培养研究进展[J].园艺与种苗，2012(3)：59-61.

[12]陈龙清，季 华，衰芳亭.荚果旅孢子的无菌培养[J].植物生理学通讯，2000,36(5)：436-437.

[13]Wang H M,Yeh D M,Lee N.Spore germinstion,Prothallus growth and gametophyte development of Adiantum capillunder in vitro and soilless culture conditions[J].Journal of the Chinese Society for Horticultural Science,1999,45(4):353-360.

[14]田晓艳，刘延吉，王 姝. 以孢子为外植体的楔叶铁线蕨组织培养[J]. 食品与生物技术学报，2007,28(4)：103-106.

[15]Hirsch A M.The effects of sucrose on the differentiation of excised ferm leaf tissue into either gametophyes or sporphtytes[J].Plant Physiology,1975(56):390-393.

[16]Teng W T.Activated charcoal affecls morphogenesis and enhances sphorophyte regeneration during leaf cell suspension culture ofPlatyceriumbifurcatum[J].Plant Cell Reports,1997,17(2):777-783.

[17]Kwa S H，Wee Y C，Lim T M，et al.IAA induced apogamy inPlatyceriumcoronarium(Koenig)Desv.Gametophytes cuhured in vitro[J].Plant Cell Reports，1995，14：598-602.

[18]蒋盛军，宋希强，王胜培，等.蕨类植物组织培养研究进展[J].园艺学报，2002，29(增刊)：651-656.

[19]程治英,张凤雷，兰芹英，等.沙椤的快速繁殖与种质保存技术的研究[J].1991,13(2)：181-188.

(责任编辑 王家银)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Technique ofDicranopterisdichotomaHance Meristem

YANG Chun-mei1，2，QU Yun-hui1*，WANG Guo-xian1,2，SHAN Qin-li1,2，WU Li-fang1,2，RUAN Ji-wei1,2，JIANG Hai-yu3**

(1.Institute of Flower,Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Yunnan Flower Breeding, Yunnan Kunming 650205, China；2.Yuxi Yunxing Bological Science and Technology Limited Campany，Yunnan Yuxi 653100,China;3.Agricultural Economics and Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Yunnan Kunming 650205,China)

The micropropagation system onDicranopterisdichotomawith spore asexplants was established.The spore bourgeon and sporophyte induction was studied through adding different growth material in minimal medium.The optimum culture medium for spores bourgeon was 1/2 MS+ sucrose 30 g/L + agar 7 g/L，and pH value was 5.8-6.0. The optimum culture medium for prothallus proliferation was 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 7 g/L.And the optimum culture for sporophyte inductio was 1/2 MS+NAA0.0 mg/L +sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L.

Dicranopterisdichotoma； Tissue culture；Rapid propagation technology；Sporophyte induction

1001-4829(2016)12-2955-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.033

2015-05-12

云南省技术创新暨产业发展专项资金(2015XB015)

杨春梅(1970-)，女，云南元江人，硕士，研究员，主要研究方向为花卉高效繁育技术研究及新品种选育,E-mail:ycm68@yahoo.cn，*为共同第一作者，**为通讯作者。

S682.35

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