C-myc基因调控COPD大鼠气道重塑及苗药对其干预的研究

徐丹 徐新毅 葛正行 刘友琴

﹙1贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002﹔2贵阳中医学院第二附属医院呼吸科，贵州 贵阳 550003﹔3贵州省人民政府机关门诊部，贵州 贵阳 550004﹚

C-myc基因调控COPD大鼠气道重塑及苗药对其干预的研究

徐丹1徐新毅2△葛正行2刘友琴3

﹙1贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002﹔2贵阳中医学院第二附属医院呼吸科，贵州 贵阳 550003﹔3贵州省人民政府机关门诊部，贵州 贵阳 550004﹚

目的 观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道重塑模型中原癌(C-myc)基因mRNA及蛋白的表达情况，探讨C-myc基因与气道重塑的关系及苗药对COPD大鼠气道重塑的干预。方法 90只雄性wistar大鼠随机分为正常组、COPD模型组、苗药组方干预组各30只。COPD大鼠气道重塑的模型制作采用熏烟法，并每月2次在气管内注射脂多糖的方法建立；苗药组方干预组大鼠于造模成功后给予灌胃治疗。处死大鼠后，分别运用实时荧光定量法﹙RT-qPCR﹚、免疫组化法检测各组大鼠气道及肺组织中原癌基因mRNA及蛋白的表达情况。结果 与正常组相比较，COPD模型组与苗药组方干预组气道及肺组织中原癌基因mRNA含量及蛋白阳性表达率明显增高﹙P<0.05﹚；与COPD模型组相比，苗药组方干预组原癌基因mRNA及蛋白阳性表达率明显降低(P<0.05)。结论 COPD大鼠气道重塑这一病理变化可能受C-myc基因的调控；苗药对COPD大鼠气道重塑模型的建立有一定程度的干预，苗药组方的应用可在一定程度上抑制C-myc基因和蛋白的表达。

C-myc； 慢性阻塞性肺疾病； 气道重塑； 苗药

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气道重塑、肺实质和肺血管的慢性炎症为主要病理变化的疾病。目前认为主要参与气道重塑的细胞有成纤维细胞和平滑肌细胞。烟雾及有毒颗粒的吸入可引发炎症并直接导致气道及肺组织的损伤，其主要原因可能与某些基因及细胞因子的异常表达有关。相关研究表明，原癌基因(C-myc)在成纤维细胞增殖中呈过度表达，显示成纤维细胞中C-myc受到激活，它可能参与了成纤维细胞的分化、增殖和表型转化[1-2]。因此，我们采用两种不同的实验方法，通过观察大鼠气道及肺组织中C-myc mRNA及蛋白的表达情况，探讨COPD气道重塑的发病机制及有效的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

健康雄性wistar大鼠90只，由重庆滕鑫生物技术有限公司提供，SPF级，动物合格证号：SCXK(渝)2012-0006；鼠龄8～9周，体质量(200±10)g，随机分为正常组、COPD模型组及苗药组方干预组各30只。

1.2 仪器及试药

一抗兔抗大鼠抗体(美国Santa Cruz生物有限公司提供)；免疫组化试剂盒(PV-9001)(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)；Star ScriptⅡFirst-strand cdna Synthesis kit合成试剂盒(北京康润诚业生物有限公司提供)。主要仪器：ABI7500实时荧光定量PCR 仪。

1.3 COPD大鼠模型制备及给药

COPD组、苗药组方干预组采用市面出售的帝豪牌过滤嘴香烟，按文献[3]方法复制COPD大鼠气道重塑模型：大鼠分置于60 cm×45 cm×50 cm自制的有机玻璃箱，箱顶部有4个2 cm大小的通气孔，每个烟熏箱内一次放置10只大鼠，每日2次，每次共20只香烟，时间持续30 min,连续28 d，第1天和第14天在气管内注射脂多糖，每次200 μg/200 μL,注射脂多糖当天不熏烟。正常组注入相同体积的0.9﹪氯化钠溶液。苗药组方干预组大鼠从造模成功后第2天起苗药灌胃(每只大鼠给予枇杷叶、紫金牛、岩白菜、鼠曲草、铁扫帚各9 g的剂量煎汤，含生药50 g/100 mL, 每天2次，每次2 mL，连续灌胃，疗程为30 d)，30 d后处死大鼠。

1.4 支气管及肺组织C-myc蛋白免疫组化检测

造模成功后的90例标本均经4﹪多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，选用链霉亲和素过氧化酶(SP)法进行。石蜡切片脱水，微波加热法修复抗原，封闭非特异性抗原后加一抗，次日加二抗加辣根过氧化酶工作液，DAB双氧水显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，中性树脂封片。每组切片任选1张用pbs液代替一抗作阴性对照，采用已知阳性切片作为阳性对照，检测C-myc蛋白的表达 。其一抗稀释比例为1︰100(美国Santa Cruz公司)。免疫组化结果判定：DAB显色强度分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性，分别记为0、1、2、3分。阳性细胞比例评分:每例标本各取4张切片,于光镜下每张切片随机选取5个高倍视野，至少计数500个细胞，算出阳性细胞比例。计分：阳性细胞比例0%～1%为0分,2%～ 10%为1分，11%～50%为2分,51%～80%为3分，81%～100%为4分。阳性染色细胞数占总细胞数的百分比与染色强度得分相乘，<2分为阴性(-); 2～3分为弱阳性(+);4～5分为中度阳性(++);≥6分为强阳性(+++)。

1.5 支气管及肺组织中C-myc基因含量的测定

开胸后取大鼠的气道及右下叶肺组织，将其分成小于100 mg的小块，置于有组织保存液的1.5 mL离心管中备用。正式实验后，把组织移入装有1 mL Trizol 的新的EP管中，并用组织匀浆器充分对组织进行匀浆，室温静置5 min, 并于4 ℃ 12 000转离心15 min, 离心后吸取上层无色透明的液体置于一个新的1.5 mL的EP管中，加入氯仿200 μL，剧烈震荡15 s,室温放置15 min。12 000转离心15 min,小心吸取上层的液体置于一个新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混合均匀，室温静置10 min ,看到白色沉淀在EP管底，4 ℃ 12 000转离心1 min，弃上清，用1 mL 75%乙醇洗涤1次，弃乙醇，在超净台上晾干，测其浓度并加入适量DEPC水。根据反转录试剂盒的要求，将所有试剂在冰上解冻后，配置反应体系，进行反转录。其引物由上海生工生物工程服务有限公司合成，C-myc基因:上游：5′-TGTCCGTTCAAGCAGATGAG-3′，下游：5′-TCACTTCCGGTCAGTTTAGTC-3′，引物长度245bp；GAPDH:上游:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC -3′，下游:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，引物长度37bp 。荧光定量PCR扩增体系为50 μL ，扩增条件：95 ℃预变性10 min ，95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸35 s，共40个循环。用2-△△CT法计算目的基因录水平的差异。

1.6 统计学方法

2 结 果

C-myc蛋白的阳性表达位于细胞质，呈棕黄色颗粒状改变，在支气管和肺上皮细胞、内皮细胞均有部分表达,其中强烈表达于成纤维细胞和平滑肌细胞。与正常组相比较，COPD模型组与苗药组方干预组气道及肺组织中原癌基因mRNA含量及蛋白阳性表达率明显增高(P<0.05)；与COPD模型组相比，苗药组方干预组原癌基因mRNA及蛋白阳性表达率明显降低(P<0.05)。见表1、表2、图1～3。

组别-+++～+++ 阳性率(%)正常组246016%COPD模型组1551050%*苗药组方干预组214530%**

注：与正常组比较，*P<0.05：与COPD组比较，**P<0.05。

表2 各组大鼠气道及肺组织C-myc 免疫组化结果(n=30)

注：与正常组比较*P<0.05：与COPD组比较**P<0.05。

图1 正常组C-myc组化染色(×200) 图2 模型组C-myc组化染色(×200) 图3 苗药组方干预组C-myc组化染色 (×200)

3 讨 论

尽管气道炎症[4]、氧化损伤[5]、感染等假说均在COPD发病中占据相当重要的地位，但其具体的发病机制至今仍未明了。己知关于COPD发生发展与体内多种基因、多条信号通路、细胞因子等密切相关。针对COPD气道壁结构这一点，其主要病理变化仍是气道重塑[6]。

C-myc基因是存在于正常细胞中能编码关键性调控蛋白的一类基因，其基因结构具有独特性，其表达与细胞生长、分化及启动细胞的增殖活性密切相关。不仅如此，C-myc基因还是Wnt的靶基因，Wnt靶基因是多样化的产品，其生物学效应多样，如控制细胞周期的进程、细胞增生、抑制凋亡、调节胚胎的发育和细胞的分化等[7-8]。刘颖格等[9]在研究中发现，C-myc基因的过量表达，还可以导致多种炎症介质的释放，这是气道重塑的主要原因 。阻断其表达，可控制患者气道重塑的症状，延长患者生命。以上研究结果均表明C-myc基因可能是参与调控COPD气道重塑的主要基因之一。本研究发现，正常组C-myc基因mRNA有少量表达，而COPD模型组C-myc基因mRNA较正常组和干预组表达增强﹙P<0.05﹚，这与COPD模型组大鼠气道成纤维细胞的增殖密切相关，其主要原因是气道成纤维细胞受C-myc基因的调控，细胞增殖引起COPD大鼠气道重塑。与COPD模型组相比，干预组C-mycmRNA及蛋白阳性表达率均明显降低(P<0.05﹚，说明苗药组方对COPD大鼠气道重塑模型的建立有一定程度的干预。

苗族居住区大量出产苗药，是我们可以利用的宝贵资源，其种类多达1 000多种。本研究主要精选枇杷叶、紫金牛、岩白菜、鼠曲草、铁扫帚等止咳抗炎苗药。现代研究结果表明：枇杷叶中三萜酸类成分有抗炎镇咳的功效[10]；据药典记载，枇杷叶具有清肺止咳、降逆止呕的功效。紫金牛属于民间中草药，具有止咳化痰、活血化瘀等作用，主要用于肺结核、慢性支气管炎[11]等疾病的治疗。岩白菜的有效成分为岩白菜素，在中医临床上常被用来治疗咳嗽、吐血等，在西医临床上主要治疗呼吸道炎症、肺炎等；不仅如此，它还有消炎、保肝等功效[12]。鼠曲草具有化痰止咳、祛风平喘之效，药食兼用，是一种不可多得的野生植物资源[13]。俞冰等[14]动物实验研究表明，鼠曲草水提取液有较好的排痰和止咳祛痰功效。铁扫帚具有止咳祛痰、清热解毒化湿的功效。周洵等[15]相关研究证实，苗药结合西药治疗COPD急性发作期有明显的疗效。本资料中经苗药灌胃治疗后大鼠气道及肺组织C-myc基因mRNA及蛋白阳性表达率均较COPD模型组明显减少，提示苗药可能通过多种途径抑制气道和肺成纤维细胞的增殖，进而缓解COPD病情的发展。

总之，本课题通过对C-myc基因与COPD气道重塑发病机制的研究，进一步明确基因调控细胞增殖在COPD发病过程中的作用，为COPD的治疗提供了新的思路和可能的、有效的治疗靶点；同时苗药的应用，让我们从民族医药中找到了有效的调节细胞增殖、抑制气道重塑的新方法。

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Study on the effects of Miao Nationality's Herbs And C-myc on airway redmeling of COPD rats

XuDan1,XuXinyi2,LiuYouqin3.

1.ChineseTraditionalMedicineCollegeofGuiyang,Guiyang550002,China. 2.TheSecondHospitalAffiliatedtoChineseTraditionalMedicineCollegeofGuiyang,Guiyang550003,China. 3.DepartmentofClinicsofGuizhouProvincialGovernment,Guiyang550004,China.

Objective To observe the level changes of C-myc mRNA and protein in the rats' lung tissue, and to explore the relationship between C-myc and airway remodeling, and explaining the effect of Miao nationality's herb on the airway remodeling. Methods 90 wistar male rats were randomly divided into NS group, COPD group, Miao nationality′s herb treatment group, and 30 in each group. The COPD rat model was built with compound factors: cigarette smoke plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS). After duplicating the mold, the rats in Miao nationality ′s herb treatment group were treated by stomach. All animals were put to death and samples were collected. The expression of C-myc mRNA and protein content in the rats' lung tissue were detected in both groups by immunohistochemistry and RT-qPCR. Results Compared with NS group, the expression of C-myc mRNA and protein content in COPD group and Miao nationality's herb treatment group showed a increasing trend, the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with COPD group, the expression of C-myc mRNA and protein content in Miao nationality's herb treatment group showed a decreasing trend (P<0.05). Conclusion C-myc may play a role in airway remodeling in COPD rats. Miao nationality′s herb was effective in both reducing airway remodeling and decreasing the expression of C-myc mRNA and protein content.

C-myc； COPD； Airway remodeling； Miaonationality 's herb

R-332

A

1000-744X(2016)02-0139-04

2015-07-16)

△通信作者，E-mail：954449965@qq.com