黄曲霉毒素B1的高效去除技术与工程化研究进展

■谢 慧 李志敏 曹胜炎 王风芹 杨 森 张军峰 宋安东*

(1.河南农业大学生命科学学院农业部农业微生物酶工程重点实验室,河南郑州450002；2.河南双成生物科技有限公司，河南漯河463900）

20世纪60年代初，科学家从发霉的花生饼中分离出黄曲霉毒素，至此人们逐渐开始对黄曲霉毒素进行研究[1]。黄曲霉毒素是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次级代谢产物，被WHO评为剧毒类物质。其结构式中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，有研究表明双呋喃环为基本毒性结构，而氧杂萘邻酮则与致癌有关[2]。

黄曲霉毒素有二十几种，常见的有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最强，因此被用来作为黄曲霉毒素的评价指标。

1 国内外AFB1的污染状况

黄曲霉喜欢潮湿温和的环境。夏季，常常发现饲料或农作物发生霉变。将大米放置在20℃，湿度为70%的环境中储存3个月后，检测到霉变的大米中AFB1的含量高达5 μg/kg[3]。黄曲霉毒素污染问题已经是一个全球性的问题，据2001年FAO评估全球有25%的农作物被黄曲霉毒素污染。

在中国，最易受到黄曲霉毒素污染的食品有粮油、酱油、坚果、玉米等。孙秀兰等[4]抽查了5个省份，203个酱油样品，结果显示AFB1的检出率为100%，其中有的酱油样品AFB1的污染量接近欧盟的限量标准。同时，食用油也是我国重点关注的对象，刘辉等[5]在2014年内从各大地区抽取1 103份食用油样品进行AFB1的污染调查，其中有24份样品不合格，不合格样品中主要是花生油，所有检测出的不合格样品中AFB1含量均大于10 μg/kg。除食品外，饲料也常常受到黄曲霉毒素的污染，刘凤芝等[6]对10个省份的饲料进行抽样调查，发现玉米副产物和蛋白饲料中AFB1污染严重，玉米中AFB1检出率达95.12%，下面依次是粕类、配合饲料、玉米加工副产品物、发酵饲料、小麦及加工副产物等其他饲料。

国外，Rouhollah等[7]对伊朗2006-2008年的玉米污染AFB1情况进行调查，调查区域有西北、西南及南部冰岛，结果显示西北地区AFB1检出率高于其他两个区域，甚至在2008年，抽查样本中100%感染了AFB1，而且 AFB1的污染量达 154.13 mg/kg。Ines Rodrigues[8]对北亚、东南亚、南亚、大洋洲和美洲5个区域1 086份样品饲料进行检测，发现有31%的样品污染了黄曲霉毒素，其中南亚地区的AFB1的污染率高达71%。Kang’ethe EK1等[9]从肯尼亚抽取了830份动物饲料样品，来自农民的饲料样品有86%污染AFB1，污染的样品中67%超过FAO的限量标准；81%的饲料厂中饲料样品被AFB1污染，污染的样品有58%达到FAO规定的上限。

2 AFB1的危害

黄曲霉毒素B1毒性特别强，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，敌敌畏的100倍[10]，严重危害着人类和动物的健康。人类患癌症的概率与当地黄曲霉污染量息息相关，有研究者从中国的淮安（食管癌高发区）、扶绥（肝癌高发区）、桓台（食管癌和肝癌低发区）三个地方共抽取了209个食物样品，淮安的AFB1污染量为13.5 μg/kg，扶绥的污染量为2.3 μg/kg，两地均大于桓台的AFB1的污染量1.3 μg/kg。由此可见，AFB1污染越严重，人类患癌症的机率越大[11]。王瑞国等[12]用不同剂量的AFB1喂养雏鸭，发现随着AFB1染毒剂量的增加，对雏鸭肝细胞DNA损伤越大。动物和人类体内摄入AFB1后，AFB1被细胞色素-P450酶利用后代谢成活性中间体AFB1-8,9环氧化物，此中间产物会与肝细胞DNA结合，形成DNA加合物，DNA加合物与肝细胞DNA鸟嘌呤碱基相互作用后，会引起肝癌[13]。

3 AFB1的去除技术

目前，市场上存在的去除方法很多，主要有物理方法、化学方法、生物方法等。

3.1 物理法

物理法通过高温加热，紫外线照射使AFB1结构破坏或通过吸附剂将AFB1吸附从而达到去除AFB1的效果。Jongin Lee等[14]将大豆置于高压锅中灭菌，与不用高压锅灭菌处理比较，AFB1的含量大大减少。大豆分别于100℃和150℃中各加热90 min，AFB1可减少41.9%和81.5%，随着温度的升高AFB1破坏的越厉害。王守经等[15]研究了高能电子束和γ-射线对AFB1辐射降解效果，发现随着辐射强度的增加，AFB1的降解率越高。Ksenija Markov等[16]的研究也证明了这一点，对47个天然污染的玉米样品用5-kGyγ-射线辐射后，AFB1的去除率达69.8%，10-kGyγ-射线照射后，AFB1的降解率提高到94.5%。李娟娟等[17]通过体外试验和动物饲养试验，研究酵母培养物提取物、水合铝硅酸盐和两者复合物这3种吸附剂对AFB1的吸附效果。研究表明，铝硅酸盐类吸附剂吸附效果最佳，在pH值8.0、10 min内吸附率达97.69%，且60 min内吸附率一直处在96.03%以上。

物理法去除黄曲霉毒素的方法操作简单，容易得到大规模的推广，且不需要耗费大量试剂、节约能源、成本低，但是也存在去除效率低、耗时等缺点。在用吸附剂吸附毒素时，吸附上的毒素会重新脱落下来而造成去除效率低和二次污染。

3.2 化学法

化学法去除AFB1的方法包括强氧化剂和碱处理，这两种方法都是通过使AFB1的某些化学键打开而达到去除效果。臭氧是一种强氧化剂，将污染AFB1的花生放置到一个臭氧发生器中，通入浓度50 mg/l，流速为5 L/min臭氧，熏蒸60 h后，检测到有89.4%的AFB1被降解[18]。除臭氧外，有人用10 g/L、料液比的5∶1（ml/g）二氧化氯溶液处理30 g(98.60 μg/kg）染有B族黄曲霉毒素的花生的霉变（浸泡30 min，处理后，黄曲霉毒素含量小于20 μg/kg，达到国标GB 2761—2005对花生中黄曲霉毒素含量的要求。随着二氧化氯溶液浓度的提高，液料比的增加，作用时间的延长，花生中B族黄曲霉毒素的含量越低,脱毒效果越好[19]。

碱可以打开AFB1的内脂环，生成无毒性或毒性较小的物质。研究发现弱碱高温处理法对花生粕原料中的AFB1有较好的去除效果。花生粕在121℃，pH 10条件下处理60 min后，AFB1的破坏率高达84.50%[20]。花生油在23.42%碱浓度下，AFB1的含量从34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg[21]。

化学法操作简单，去除效果极佳，而且成本低。化学法所用的试剂有强氧化性，比如臭氧，虽然能有效去除黄曲霉毒素，但是如果操作不当会对操作人员造成伤害，污染环境。化学试剂会破坏饲料的营养物质，同时所加入的试剂很难回收，对饲料造成二次污染等。

步骤3 为不失一般性，对定标信号进行每隔两个抽取一个，共抽取2 000帧信号，利用式(3)和式(4)计算该2 000帧的幅度和相位误差值，并计算幅度和相位误差的平均值和

3.3 生物法

黄曲霉毒素的生物脱毒主要是通过微生物或其产生的酶制剂来进行脱毒，目前报道的生物脱毒的微生物有枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、酵母菌、黑曲霉等，酶制剂有锰过氧化物酶、葡糖糖氧化酶等。

Mohsen Farzaneh等[22]分离出了一株能够降解的枯草芽孢杆菌菌株UTBSP1，该菌株可以降解肉汤培养基中AFB1，降解率为85.66%，降解开心果中95%的AFB1。Ali Topcu等[23]研究了屎肠杆菌降解AFB1的能力，发现在培养48 h后，大约有40%的AFB1被降解。有研究分别采用高温高压法、添加1%乳酸菌和1%酵母菌这3种方法处理试样，并测定其AFB1含量。结果发现，经高温和高压处理可破坏27.7%的AFB1；经乳酸菌30℃厌氧培养72 h，可使99.4%的AFB1得到破坏；经酵母菌30℃培养72 h可使83.4%的AFB1得到降解[24]，由此可见，生物法去除AFB1更加高效。

除此之外，酶制剂也被人广泛研究，有研究发现白腐菌种中的锰过氧化物酶可去除86.0%的AFB1[25]；用5%的25 U/g葡萄糖氧化酶完全可以解除饲料中500 μg/kg浓度AFB1的毒性[26]。

生物降解法是目前最环保最高效的降解方法，不仅可以有效降解毒素，还能提高饲料或食品的营养价值，不会造成二次污染。生物法有其一定的场地局限性，有的需要无菌操作等，所以不利于大规模工程化使用。

4 黄曲霉毒素B1的去除机理

黄曲霉毒素的结构式中含有双呋喃环和氧杂萘邻酮，结构较为复杂，所以其降解途径也较为复杂。目前，人们对AFB1的降解途径研究甚少，而且不同的去除方法，对应不同的降解产物。有关物理和化学方法去除机理的报道很少，有些报道只是简单地叙述了降解途径，具体的键的断裂与重组没有过多涉及，甚至有研究对其降解途径进行了猜想，但没有完全证实。

目前，有关生物降解机理的报道较多，Wang J等[25]研究了白腐菌中锰过氧化物酶降解AFB1的途径，AFB1被锰过氧化物第一次成了AFB1-8,9-氧化物，之后被水解成AFB1-8,9-二氢二醇，降解产物的毒性远远小于AFB1。Chen等[27]在通过嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚菌厌氧固态发酵生物转化AFB1研究中，对降解机制进行了猜想，他们假定AFB1绑定在花生蛋白上，进过加热处理后，AFB1从蛋白上脱落下来，小部分的AFB1转换成毒性较弱的AFD1，大部分的AFB1进过厌氧固态发酵后，在用高效液相分析时，显示AFB1被三氯醋酸衍生成无毒的AFB2a。

Melvin S Samuel等[28]通过恶臭假单胞杆菌对AFB1进行解毒，并且对其降解产物进行了分析，报道中显示有三种降解产物，前两种降解产物是AFB1的内脂环打开导致脱碳作用形成的，第三种降解产物是苯酐，但是关于苯酐的形成机理尚不清楚。

Wajiha Iram等[29]对柠檬酸降解AFB1的降解机制进行了详细叙述，AFB1有6种裂解途径，形成8种降解产物。降解产物的形成主要是H、CO和CO2的缺失，或者和-OH的添加，或者碳的添加等。

5 黄曲霉毒素B1去除方法的工程化应用

5.1 物理挑选法

色选机是工厂中普遍采用的物理挑选法来去除黄曲霉毒素的设备，目前已经投入生产，其工作原理是利用光学系统，根据正常粮食和霉变粮食的颜色不同，正常粮食按原路自由落体下去，霉变粮食被吹出，从而达到分离效果[30]。色选机设备如图1所示[31]。

色选机在粮食生产中应用比较广泛，据林茂先等[32]报道，6SXM-XXXXBW型小麦色选机每小时至少可以筛选4 t小麦，多者可达26 t，经过色选后的小麦品质发生了较大的变化，常规清理设备清除不掉的病斑、霉变的小麦颗粒及赤霉病等有害颗粒被色选机基本清除，清除率高达99.7%。由浙江齐鲤机械有限供公司生产的MSXG-120型大米色选机，采用双向筛选室，并安装了高敏度传感器，使能更彻底地分离出微小色差的物体，其每小时可色选2～4 t的大米[33]。

图1 色选机

除色选机外，市场上还存在一种大米刷糠机，其依据面粉厂的刷麸机改造而成，每小时可刷3.5 t以上的大米，从实验结果可以看出，对于污染较轻的大米去毒效率可达100%，然而对于污染较严重的大米则去毒效率不高[34]。大米经过刷糠机后，AFB1得到高效去除，同时大米的质量也得到了有效改善。

5.2 紫外照射法

花生、大豆等作物在种植过程中，会受黄曲霉污染，经压榨成食用油后，毒素会随之进入油中，食用油中黄曲霉毒素的去除常采用紫外线照射。压榨花生油工艺的生产线是先将原料经压榨物理精选后，采用紫外瞬时辐照技术去除AFB1。压榨好的花生油通过紫外照射装置时，受到紫外线发生器产生的紫外线照射，使液体中的黄曲霉毒素分解，当多个照射装置串联后连续照射液体，含毒量大于50 μg/kg的花生油，处理后油中毒素可降至20 μg/kg以下。这一套装置已经成熟，从1982年至1985年试机中，累计处理含毒花生油690 t[35-37]。张小勇等[38]研制了一套采用UVA紫外灯辐照的方式连续降解食用植物油中AFB1的设备，该设备功率小，能耗少，且可实现在线清洗，保证了辐射解毒效果，在辐照反应15 min后，黄曲霉毒素降解率高达95%以上。此套设备如图2所示，将AFB1超标的花生油从储油罐中进入AFB1降解设备，经过紫外照射后的花生油经回流罐回流入原储油罐，若检测合格，则调整阀门流入成品罐。

图2 紫外照射装置

除此之外，广东省粮食科学研究所研制的LZB15型紫外光照去除黄曲霉毒素设备，能耗低、处理费用小、劳动强度低，累计处理了1 670 t花生油，效果良好[39]。目前，有好多设备厂已经研制出黄曲霉毒素降解设备，设备大多采用紫外照射法，去除率高达90%以上[40]。

5.3 臭氧降解法

国内外对臭氧降解法去除黄曲霉毒素做了许多研究，通过对臭氧浓度、处理时间等一些参数的调节，毒素可有效降解[41-42]。臭氧去除发霉饲料工艺操作简单，投资小，所以许多饲料厂采用臭氧发生装置来达到大规模去除黄曲霉毒素的效果。山长坡等[43]为了高效降解花生中黄曲霉毒素，研制了一套臭氧降解黄曲霉毒素的设备，如图3所示。这套设备采用耐腐蚀不锈钢的材质制成，由臭氧发生器、臭氧运输系统、花生脱毒罐等构成，在室温下，当臭氧浓度89 mg/l，臭氧流速为1 L/min，搅拌速度70 r/min，臭氧相对湿度50%，处理时间30 min时，此时，花生中AFB1降解率为82.6%。

图3 花生臭氧脱毒装置

除此之外，还存在一种臭氧脱毒装置，没有臭氧发生装置，但是有一个臭氧熏蒸室，发霉饲料先放入熏蒸室中，通入一定浓度的臭氧后，熏蒸一定时间，黄曲霉毒素可得到有效去除（图4）。研究表明，在此装置中通入浓度为6 mg/l,熏蒸半个小时后，AFB1最大的降解率达到66%[44]。

图4 臭氧熏蒸装置

5.4 三种工程化设备比较分析

上述三种工程化设备适用于不同的原料，各有优缺点，如表1所示。

表1 三种设备对比分析

色选机主要是挑选不合格的粮食原料，不管是霉变、长黄斑、空壳的粮食都可以去除，对于去除霉变粮食没有专一性。其设备要求简单，占用场地面积小，但是其存在工作效率低，毒素去除效果不显著的缺点。色选机在碾米厂和面粉厂被大规模应用，不仅可以有效地剔除发霉粮食，而且工艺简单，易于得到推广。

食用油的生产过程中，黄曲霉毒素超标事件常常发生，所以在食用油生产流水线上常安装一套紫外照射装置，分解黄曲霉毒素。这套装置可以实现连续性去除黄曲霉毒素，且效率高，设备能耗低，同时紫外照射还会起到杀菌的作用，不足的是，紫外照射花生油后，会对花生油的品质造成破坏，损坏不饱和脂肪酸，且使花生油产生大量自由基，进而导致油脂更易变质[45]。

臭氧脱毒装置一般应用于发霉饲料厂或食品加工业中，该装置需要不锈钢抗氧化性好的材料制成，为了去除均匀，脱毒罐中安装了搅拌器，所以设备成本相比前两种要高，但是其自动化程度高，劳动强度小，解毒效果明显，被人们广泛应用。

6 结束语

一直以来，黄曲霉毒素污染问题被人类广泛关注。目前，已经有大量文献报道了如何去除黄曲霉毒素，其中物理方法操作简单，对物质的营养成分破坏小，被人们广泛利用，走上了工业化。色选机的发明和紫外照射装置的出现，实现了大规模的降解黄曲霉毒素，效果较好，这两种设备在面粉厂和食用油加工厂中较为常见。化学法所用的试剂会对营养物质造成破坏，处理后饲料的适口性会变差，而且有的成本太高，不利于工业化使用，只有臭氧解毒方法实现了工业化。生物解毒方法是目前最有前景的解毒方法，其环保无污染，而且高效，但是无法实现工业化。对于解毒方法的研究，大多数是处于实验室水平，有的虽然很高效，但是很难扩大化，这就需要以后的研究者们，可以根据实际生产情况，研究出更加经济又实用的方法，走向工业化。