新疆维吾尔族人群中MTHFR、MTRR基因多态性与NAFLD的相关性

阿迪拉·阿地江，蔡雯，姚华，马琦

(1新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐830011；2新疆医科大学护理学院；3新疆医科大学第一附属医院代谢性疾病重点实验室)

新疆维吾尔族人群中MTHFR、MTRR基因多态性与NAFLD的相关性

阿迪拉·阿地江1，蔡雯2，姚华1，马琦3

(1新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐830011；2新疆医科大学护理学院；3新疆医科大学第一附属医院代谢性疾病重点实验室)

目的 探讨新疆维吾尔族人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)及甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因多态性与非酒精性脂肪肝(NAFLD)的相关性。方法 选取维吾尔族NAFLD患者325例作为NAFLD组，选择健康体检的维吾尔族居民304例作为非NAFLD组，对研究对象进行问卷调查、体格检查以及血液生化指标的检测。应用多重高温连接酶检测反应技术检测两组MTHFR 基因C677T、A1298C位点及MTRR基因A66G位点的多态性。采用Logistic多因素回归法分析维吾尔族NAFLD与MTHFR 基因C677T、A1298C位点及MTRR基因A66G位点多态性的相关性。结果 两组MTHFR 基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点基因型及等位基因的分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。调整混杂因素后，Logistic 回归分析显示，MTHFR 基因A1298C基因位点在隐性模型下与NAFLD有相关趋势(OR=2.023、P<0.05)，在其余加性模型和显性模型的基因型分布差异无统计学意义(P均>0.05)。MTHFR 基因C677T位点、MTRR基因A66G位点的加性模型、显性模型和隐性模型下的基因型分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 新疆维吾尔族人群中MTHFR基因A1298C基因位点多态性与NAFLD的发生有关，AA基因型可能增加NAFLD的发病风险。

非酒精性脂肪肝；维吾尔族；新疆；基因多态性；亚甲基四氢还原酶；甲硫氨酸合成酶还原酶

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是参与体内叶酸代谢的关键酶。研究表明，MTHFR、MTRR基因的多态性影响着其编码的酶活性，从而影响体内叶酸及同型半胱氨酸的水平。同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸循环的中间产物，肝脏是其主要的代谢场所。Hcy通过影响脂质代谢，促进脂质的堆积及脂肪肝的形成。新疆维吾尔族人群具有遗传结构及饮食习惯的特殊性，是NAFLD的高发人群，但该基因在维吾尔族NAFLD中的研究尚未有报道。2015年1月～2016年1月，我们对325例新疆维吾尔族NAFLD患者MTHFR、MTRR基因的多态性进行研究，探讨新疆维吾尔族人群MTHFR、MTRR基因多态性与NAFLD的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2016年1月在新疆医科大学第一附属医院新入院的维吾尔族NAFLD患者325例作为NAFLD组(病例组)，其中男151例、女174例，年龄(42.89±9.57)岁。均经腹部B超检查确诊NAFLD，NAFLD诊断参照2010年中华医学会肝脏病学分会《非酒精性脂肪性肝病诊断指南(修订版)》的诊断标准。纳入标准：无饮酒史或折合饮酒量为男性<140 g/周或40 g/d，女性<170 g/周或20 g/d；肝脏B超或影像学诊断符合弥漫性脂肪肝的影像学诊断标准。排除标准：合并高血压、2型糖尿病、恶性肿瘤、酒精性脂肪肝、药物性脂肪肝、甲状腺功能紊乱、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、严重感染、恶性肿瘤及资料不全者等。选择在新疆医科大学体检中心健康体检的维吾尔族人群304例作为非NAFLD组(对照组)，其中男137例、女167例，年龄(42.44±10.06)岁。纳入标准：B超检查无脂肪肝且排除恶性肿瘤史、手术史、肥胖症、高血压、糖代谢异常、血脂代谢异常、高尿酸血症。

1.2 基因多态性检测方法 所有受试者禁食8 h以上，于次日清晨采集静脉血2 mL，EDTA抗凝，充分混匀后-80 ℃保存。采用Omega基因组DNA试剂盒快速提取全血基因组DNA。应用多重高温连接酶检测反应技术(iMLDR)，多重PCR引物设计。MTHFR C677T rs1801131多态性位点引物序列：正义链5′-GACCATTCCGGTTTGGTTCTCC-3′，反义链5′-TGTCAGGAGTGTGCCCTGACCT-3′。MTHFR A1298C rs1801133多态性位点引物序列：正义链5′-CATGCCTTCACAAAGCGGAAGA-3′，反义链5′-CTCT-CTCTGCCCAGTCCCTGTG-3′。MTRR A66G rs1801394多态性位点引物序列：正义链5′-TGTGTGGGTATTGTTGCATTGTTTC-3′，反义链5′-ACGGCTCTAACCTTATCGGATTCA-3′。多重PCR产物纯化(在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min)；连接反应体系：10×连接缓冲液 1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、纯化后多重PCR产物2 μL、ddH2O 6 μL混匀；将连接产物上ABI 3730XL测序仪进行分型检测，对MTHFR基因C677T rs1801131、A1298C rs1801133和MTRR基因A66G rs1801394多态性位点进行检测。

2 结果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析Hardy-Weinberg分析结果表明，MTHFR基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P均>0.05)。

2.2MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点基因型及等位基因的分布 两组MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点基因型及等位基因的分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1～3。

2.3 维吾尔族NAFLD患者危险因素Logistic回归分析MTHFR基因A1298C基因位点的AA基因型是NAFLD发病的危险因素(OR=2.023，P<0.05)，其余加性模型和显性模型的基因型分布差异无统计学意义(P均>0.05)。MTHFR 基因C677T位点、MTRR基因A66G位点的加性模型、显性模型和隐性模型下的基因型分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4～6。

表1 两组MTHFR基因C677T位点基因型及等位基因分布(例)

表2 两组MTHFR基因A1298C位点基因型及等位基因分布(例)

表3 两组MTRR基因A66G位点基因型及等位基因分布(例)

表4 维吾尔族NAFLD和C677T多因素非条件Logistic回归分析

表5 维吾尔族NAFLD和A1298C多因素非条件Logistic回归分析

3 讨论

NAFLD的发生、发展涉及遗传、环境和生活方式等多种因素。近年来，随着生活水平的提高、饮食结构的改变，与肥胖症、糖脂代谢紊乱相关的NAFLD发病率不断上升。目前NAFLD发病机制尚未完全明确。新疆是个多民族聚集地区，遗传背景、生存环境、生活方式和膳食习惯具有特殊性，使得其人群肥胖的流行状况和特征与汉族人群不同，相对于当地的汉族人群，维吾尔族NAFLD的患病率较高。

表6 维吾尔族NAFLD和A66G多因素非条件Logistic回归分析

Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸循环的正常代谢产物，体内不能合成，是能量代谢和许多需甲基化反应的重要产物。Hcy通过影响脂质代谢，促进脂质沉积及脂肪肝的形成，其中85%的Hcy转硫作用在肝脏进行，因而Hey的代谢异常容易导致肝脏损伤。多种慢性肝脏损伤的情况均可以出现Hcy水平升高。Pogribny等[1]研究发现，蛋氨酸相关基因缺乏的小鼠Hcy水平明显升高，而这些小鼠易发生脂类代谢异常。

MTHFR及MTRR均是叶酸 Hcy代谢过程中的关键酶。MTHFR不可逆地将5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-CH2-THF)还原为5-甲基四氢叶酸(5-CH2-THF)。MTHFR基因多态性导致的酶活性降低是Hcy水平升高的危险因素。MTRR是叶酸-Hcy代谢过程中的另一关键酶，以维生素B12为辅酶参与Hcy复甲基化为甲硫氨酸的过程。MTRR基因发生变异可能会引起血浆Hcy水平升高。

现已发现的MTHFR基因有多种突变型，不同的突变型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响，其中常见的突变有以下几种： ①677C→T。是MTHFR最常见的突变位点，是第677位密码子胞嘧啶(C)被胞嘧啶(T)置换，从而使编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致MTHFR基因的热稳定性降低，使酶活性降低，从而引起Hcy升高[2,3]，引起NAFLD。Christensen等[4]研究发现，欧洲人群MTHFR基因C677T等位基因的频率为22%～44%。在亚洲人中，日本人C677T等位基因频率为34%[5]。于佳梅等[6]研究发现，中国汉族人C677T等位基因频率为40%，认为亚洲人突变频率偏高。陈红华等[7]首次在国内研究了MTHFR C677T基因多态性与NAFLD的相关性，并证实MTHFR C677T基因多态性是NAFLD的危险因素。② A1298C突变。此点突变位于第7外显子的1298位点，为一个胞嘧啶取代腺嘌呤，从而使基因编码的谷氨酸被丙氨酸替换[8]。 对MTHFR基因A1298C突变频率在人群中的分布研究显示，亚洲人群中的基因频率为17%～19%，欧洲为27%～36%。Yang等[9]研究发现，中国南方汉族人群A1298C多态性基因的基因频率均低于新疆地区汉族人群。Sun等[10]经Meta分析证实，MTHFR基因的A1298C是NAFLD发病的危险因素。而Benan[11]等研究未能证实此位点与NAFLD有相关性，所以此位点与NAFLD的相关性还需进一步探讨。MTRR基因错义突变是引起此酶缺乏或活性降低的主要机制，其中基因多态性研究较多的是第66位点腺嘌呤到鸟嘌呤突变导致的蛋氨酸被异亮氨酸替代，是该酶的活性降低从而引起体内Hcy水平升高[12]，从而导致NAFLD的发生，在中国人群中研究甚少，平均基因频率为28%～31%。在欧洲基因频率为56.0%、南美洲为26.1%，亚洲为28.0%[13]。对于MTHFR及MTRR基因多态性与NAFLD的关系在国内外研究甚少。

本研究发现，两组MTHFR 基因C677T、A1298C位点和MTRR A66G基因位点基因型及等位基因的分布差异无统计学意义，在MTHFR 基因A1298C基因位点的隐性模型中有统计学意义，AA基因型在NAFLD的发生过程中是风险因素，而在MTHFR C677T和MTRR A66G基因型均无统计学意义，提示MTHFR A1298C基因中的AA基因可以增加NAFLD发生率，可作为预测维吾尔族NAFLD的重要评估指标之一。由于本研究仅限于新疆维吾尔族常驻人口，样本具有局限性并且样本量较少，加之目前对维吾尔族人群MTHFR基因与MTRR基因的研究较少，本研究的结论尚需更大样本量的流行病学调查进一步验证。

[1] Pogribny IP, Kutanzi K, Meknyk S, et al. Strain-dependent dysregulation of one-earbon metabolism in male mice is associated with choline and folate-deficient diet-induced liver injury[J]. FASEB J, 2013,27(6):2233-2243.

[2] 朱静.叶酸、核黄素缺乏及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对人类遗传物质稳定性的影响[D].昆明：云南师范大学,2006.

[3] 刘婉婉,董宪喆,刘屏，等.MTHFR-C677 T基因多态性-抑郁症治疗的新思路[J].中国药理学通报,2015,(7):915-919.

[4] Christensen JS, Mikael LG, Leung KY, et al. High folic acid consumption leads to pseudo-MTHFR deficiency,altered lipid metabolism, and liver injury in mice[J]. Am J Clin Nutr, 2015,101(3):646-658.

[5] Kalhan SC, Edmison J, Marczewski S, et al. Methionine and protein metabolism in non alcoholic steatohepatitis: evidence for lower rate of transmethylation of methionine[J]. Clin Sci(Lond), 2011，121(4):179-189.

[6] 于佳梅,王新春,陈白滨,等.中国5个民族亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的研究[J].人类学学报,1998,17(3):79-83.

[7] 陈红华,郭佳佳,王仁萍,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与非酒精性脂肪肝的相关性研究[J].中华全科医学,2014,12(12):1920-1922.

[8] Pandey SK, Singh A, Polipalli SK, et al. Association of methylene tetrahydrofolate reductase polymorphism with BMD and homocysteine in premenopausal north lndian women[J]. J Clin Diagn Res, 2013,7(12):2908-2919.

[9] Yang B, Liu Y, Fan S, et al. Geographical distribution of MTHFR C677T, A1298C andMTRR A66G gene polymorphisms in China: findingsfrom 15357 adults of han nationality[J]. PLoS One, 2013,3(8):1-9.

[10] Sun MY, Zhang L, Shi SL, et al. Association between methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) polymorphisms and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) risk: a meta-analysis[J]. PLoS One, 2016,11(4)：e0154337.

[11] Benan K, Cansel T, Kadir SY, et al. MTHFR 677C/T and 1298A/C mutations and non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clin Med, 2015,15(3):148-251.

[12] 余科.叶酸代谢酶基因多态性与肿瘤易感性的Meta分析[D].上海：复旦大学,2009.

[13] Carvalho SC, Muniz MTC, Siqueura MD, et al. Plasmatic higher levels of homocysteine in Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J]. Bio Med Central, 2013,12(37):1-5.

Correlations between MTHFR and MTRR gene polymorphisms and NAFLD in Uygur population of Xinjiang

AdilaAdijiang1,CAIWen,YAOHua,MAQi

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective To investigate the correlations between the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) gene polymorphisms and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in Uygur populations from Xinjiang. Methods Totally 325 Uygur patients with NAFLD (NAFLD group) and 304 healthy controls from physical checkups were selected. Questionnaire survey, physical examination and detections of blood biochemical indexes were conducted. The gene polymorphisms of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G in the two groups were detected by improved multiple ligase detection reaction. The correlations between NAFLD and gene polymorphisms of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G in Uygur populations from Xinjiang were analyzed by multivariate Logistic regression. Results No significant difference was found in the genotype and allelic distribution of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G between the NAFLD and the control group (P>0.05). After adjusting confounding factors, an association of MTHFR A1298C with NAFLD was observed in the recessive model (OR=2.023,P<0.05), while in the additive and dominant models, no statistically significant difference was found (P>0.05). No statistically significant difference was found in the genotype distribution of MTHFR 677T and MTRR A66G in the additive model, dominant model and recessive model (P>0.05).Conclusion The gene polymorphism of MTHFR A1298C is associated with the occurrence of NAFLD in Xinjiang Uygur population and AA genotype may increase the risk of NAFLD.

non-alcoholic fatty liver disease; Uygur nationality; gene polymorphisms; methylenetetrahydrofolate reductase; methionine synthase reductase

国家自然科学基金资助项目(81460120)。

阿迪拉·阿地江(1988-)，女，在读硕士研究生，主要研究方向为基因疾病与健康。E-mail: 505335248@qq.com

简介：姚华(1959-)，男，博士，教授，主要研究方向为基因疾病与健康。E-mail: yaohua01@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.005

R575.2

A

1002-266X(2016)46-0020-04

2016-08-31)