植物NBS类R基因的分类、进化、调控及应用

刘静，畅志坚，郭慧娟，李欣，张晓军，詹海仙，任永康，乔麟轶，

（1.山西大学研究生院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西太原030031）

植物NBS类R基因的分类、进化、调控及应用

刘静1，畅志坚2，郭慧娟2，李欣2，张晓军2，詹海仙2，任永康2，乔麟轶1，2

（1.山西大学研究生院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西太原030031）

NBS类抗病基因作为抗病基因中数目最多的家族，在植物抵御病虫害中起着关键作用。综述了NBS类抗病基因的分类、功能、数目、起源进化、表达调控以及应用等方面的研究进展，并对该类基因的研究前景进行了展望。

NBS；分类；进化；调控；应用

植物在生长过程中不断面临着真菌、细菌、病毒、线虫等病原体的侵袭，而在长期的进化过程中植物也逐渐形成了一系列复杂的防御机制，特别是植物抗病基因编码的蛋白对病原体的特异性识别。随着对抗病基因及其编码产物的结构与功能研究，以及植物信号转导途径中其他组分的进一步解读，人们对有关植物与病原体互作、抗病基因进化的分子机制的研究不断深入。尽管基因产物针对的病原体及致病因子截然不同，但其植物抗性基因的分子内结构特征相对十分保守，常见的有蛋白激酶（protein kinase，PK）、跨膜结构域（transmembrane domain，TM）和核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）等，其中，NBS类基因是植物中普遍存在的抗病基因，在植物抵抗各种病原物侵袭的过程中发挥着重要作用。

1 NBS类抗病基因的分类、功能及数目

NBS结构域是该类基因所编码蛋白中最保守的序列，存在于真核生物的许多蛋白中（如ATP合酶的亚基、核糖体延伸因子、ras蛋白等），能够结合ATP或GTP，可能参与抗病信号的传导[1]。根据NBS类抗病基因编码蛋白的N端结构不同，可将其分为TIR-NBS-LRR（TNL）和non-TIR-NBS-LRR（non-TNL）两类。其中，TIR通过与病原物及其产物的结合，产生信号并将信号传递给传导因子，从而引发抗病反应[2]；LRR结构域由一系列相似重复的模体构成，主要参与对Avr蛋白的特异性识别[3-4]；non-TNL的N端为CC卷曲螺旋结构[2]，该结构由2个或2个以上的螺旋相互作用形成一个超级螺旋，分散在疏水氨基酸残基中，与病原产生的配体结合，进而感知病原侵染。

NBS类抗病基因广泛存在于植物基因组中，目前，多种植物的NBS类抗病基因的数目已确定。由表1可知，数目最少的为短柄草，只有23个，而小麦高达1 219个，差异较大可能是由基因组大小不同[5]以及在进化过程中病虫害和环境选择压力不同所造成的[6]。

表1 16种植物中NBS类抗病基因数目

2 NBS类抗病基因的起源与进化

许多研究表明，NBS，LRR，TIR，CC结构域在抗病基因发挥作用中必不可少，因此，研究这些结构域的起源是研究抗病基因起源中的最关键部分。随着植物全基因组序列的不断公布以及基于BLAST的同源搜索和简并引物PCR的产生，有关结构域起源的研究已取得了一定进展。2002年，Meyers等[15]通过在小立碗藓的ETS数据库BLAST搜索发现，其中2个TIR序列在陆生植物中普遍存在。同年，Akita等[16]通过简并引物PCR法，也发现了TIR类似片段。2012年，Yue等[17]对NBS类抗病基因的起源进行了更深的研究，结果表明，TNL类起源于苔藓类植物，non-TNL类起源于石松类植物，且NBS，LRR各自在真核生物和原核生物之前已出现，但在陆生植物中才发生融合，随后扩展到被子植物和裸子植物中。

有研究还发现，NBS结构中既存在保守型区域，也含有多态性的片段，推测NBS基因在进化过程中，一些具有重要功能的结构域被保存下来，而为了适应多变的环境产生了变异。导致真核生物的基因数目及复杂度增加的最重要原因为基因复制[18]，其有助于基因网络的进化，并为新遗传系统以及基因功能的进化提供了新素材。例如，Martin等[19]对莴苣基因组研究发现了通过染色体复制产生的整套新的抗性基因簇；Pamiske等[20]研究发现，cf9基因至少存在2个同源基因族，暗示cf类型基因是DNA复制的产物；Wang等[21]研究表明，xa21基因家族中含有17 kb的大片段重复，说明有基因参与复制的迹象。

在被子植物和裸子植物中，TNL和non-TNL 2种类型的NBS抗病基因都存在，而在双子叶植物中只有TNL类型存在。有关数据表明，这2种类型的进化模式不同，Zhong等[22]通过对反义替换Ka与同义替换Ks的比值研究TNL，non-TNL的进化模式，结果发现，不同植物中其比值可能大于1，也可能小于1，即不同植物有不同的生命历程，其TNL，non-TNL多样化的进化模式是由其所在的特定生态环境所决定。

3 NBS类抗病基因的表达与调控

植物NBS类抗病基因的表达存在差异性，即在不同物种或同一物种不同组织器官中表达有先后，且表达产物以及表达量有差异。Akita等[16]研究发现，苔藓植物中，NBS类抗病基因的表达与发育有关，在配子体阶段，其表达水平比丝状体高。宋霄等[23]对MdNBS-LRR1基因的组织表达特异性进行检测，结果显示，MdNBS-LRR1在分析的6种组织中均有表达，但在幼叶中的表达量最高。杨慧等[24]也比较了PB-LRR基因在野生型水稻不同器官中的表达模式，结果表明，PB-LRR基因在水稻叶片中的表达水平约是根中的13倍。

植物抗病基因的表达除具有组织特异性外，主要还受环境、生长调节剂、miRNA以及转录因子的调控。Wang等[25]对含NBS结构的OsRP1L1基因在高盐、高低温、强渗透压条件下的表达情况进行了研究，其中，高盐、高温抑制该基因的表达，而强渗透压与低温对其表达影响较小。Que等[26]研究发现，水杨酸对甘蔗NBS基因（SNLR）的表达有一定的影响。Guo等[27]测定了水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（TE）等对水稻苗期NBS基因（DEPG1）表达的影响，结果表明，这3种激素均不同程度地抑制DEPG1基因的表达。

病原菌侵染导致抗病基因的瞬时表达，由于表达量过高可能会引起过敏性反应，从而导致细胞的局部死亡，这对植物生长发育非常不利；而植物可通过其内源性抗病毒防御系统的转录及转录后水平调控引起基因沉默，进而影响基因的表达。He等[28]在白菜中发现了一个特有的miRNA，可以靶向沉默TNL类基因，并证明这个miRNA可以被TuMV诱导表达，使TNL基因被切割降解。2009年，Klevebring等[29]对杨树基因组中的miRNA进行预测验证，结果发现了1个新的miRNA，其靶基因为NBS-LRR类抗病基因，可能调控该类基因的表达。当病原菌侵染植物后通过信号传递把转录因子激活，转录因子与抗病基因的启动子结合，从而引起基因表达。

4 NBS类抗病基因的应用

随着克隆技术的发展，对抗病基因的结构有了全面的认识，发现这些基因都含有几个高度保守的结构域，利用其保守性，目前在许多植物中已克隆出抗病基因同源物。Klevebring等[29]利用TIGR和NCBI数据库，对R基因保守结构域的关键词进行搜索，获得900条RGA。高树广等[30]根据已知植物抗病基因的NBS-LRR类保守结构域，合成1对简并、2对特异引物，对6个芝麻品种中的抗病基因进行扩增，得到11条抗病基因同源序列。Ilag等[31]利用拟南芥的NBS-LRR抗病基因Rps2作为探针，从水稻IR64中筛选出3个NBS-LRR同源序列NRH1，NRH2和NRH3。张立荣等[32]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构P-loop和GLPL合成简并引物，对小麦近等基因系TcLr24基因组DNA进行PCR扩增，得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物。利用NBS抗病基因克隆出的RGA通常被应用于分子标记的开发，基于RGA开发的标记主要有RFLP，STS，SSCP，CAPS和SSR等。Liu等[33]从25个花生RGA中开发出28个SSR标记，并将其中一个标记RGA121定位到连锁群AhIV上。Samuelian等[34]同样也从9个覆盆子RGA中开发出3个CAPS标记。除以上2种外，通过转基因技术NBS类抗病基因已在植物抗病育种中得到应用。李海霞等[35]采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TNL抗病基因（PtDRG01）导入烟草中，经抗生素筛选和PCR分子检测，获得一批阳性转化植株。郭立佳等[36]通过构建NBS-LRR类基因Osxoc1334的超量表达载体，并在农杆菌EHA105介导下转化中花11号水稻，最终获得6株再生植株。

5 展望

近年来，随着生物信息学的快速发展，部分植物的基因组测序相继完成。目前，已对NBS类抗病基因在全基因组水平上进行了较全面的分析，主要包括基因结构、数量、分布以及与其他植物NBS类基因的进化和亲缘关系的比较分析，但是对于NBS类基因的表达调控机制研究还有待进一步深入。对于大部分NBS类抗病基因来说，其只具有专化抗性，随着病原菌的变异，植物抗病性很容易丧失。因此，发掘和克隆具有广谱性的抗病基因将是NBS类抗病基因研究的重要内容。

［1］Kohler A，Rinaldi C，Duplessis S，et al.Genome-wide identification of NBS resistance genes in Populus trichocarpa[J].Plant Molecular Biology，2008，66（6）：619-636.

［2］Meyers B C，Kozik A，Griego A，et al.Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2003，15（4）：809.

［3］Porter B W，Paidi M，MingR，et al.Genome-wide analysis of Carica papaya reveals a small NBSresistance gene family[J].Molecular Genetics and Genomics，2009，281（6）：609-626.

［4］曹必好，宋洪元，雷建军.植物抗病基因研究进展[J].天津农业科学，2001，7（4）：13-18.

［5］Richter T E，Ronald P C.The evolution of disease resistance genes [J].Plant Molecular Biology，2000，42（1）：195-204.

［6］Michelmore R W，Meyers B C.Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process[J]. Genome Research，1998，8（11）：1113-1130.

［7］Luo S，Zhang Y，HuQ，et al.Nucleotide-binding site and leucine-rich repeat-encoding genes in the grass family[J].Plant Physiol，2012，159（1）：197-210.

［8］Lin X，Zhang Y，Kuang H.Frequent loss of lineages and deficient duplications accounted for low copy number of disease resistance genes in Cucurbitaceae[J].BMCGenomics，2013，14（1）：1-13.

［9］Yang S H，Zhang X H，Yue J X，et al.Recent duplications dominate NBS encoding gene expansion in two woody species[J].Molecular Genetics and Genomics，2008，280（3）：187-198.

［10］Li J，Ding J，Zhang W，et al.Unique evolutionary pattern of numbers of gramineous NBS-LRR genes[J].Mol Genet Genomics，2010，283（5）：427-438.

［11］Li XY，ChengY，Ma W，et al.Identification and characterization of NBS-encoding disease resistance genes in Lotus japonicus[J]. Plant Systemat Evol，2010，289（1/2）：101-110.

［12］刘云飞，万红建，韦艳萍，等.番茄NBS-LRR抗病基因家族全基因组分析[J].核农学报，2014，28（5）：790-799.

［13］Torregrosa C A，Wang B B，O'Bleness MS，et al.Identification and characterization of nucleotide-binding site-leucine-rich repeat genes in the model plant Medicago truncatula[J].Plant Physiology，2008，146（1）：5-21.

［14］Monosi B，Wisser R J，Pennill L，et al.Full-genome analysis of resistance gene homologues in rice[J].Theor Appl Genet，2004，109（7）：1434-1447.

［15］Meyers B C，Morgante M，Michelmore R W.TIR-X and TIR-NBS proteins：twonewfamiliesrelatedtodiseaseresistance TIR-NBS-LRR proteins encoded in Arabidopsis and other plant genomes[J].BMCResearch Notes，2002，32（1）：77-92.

［16］Akita M，Valkonen J P.Anovel gene familyin moss（Physcomitrella patens）shows sequence homology and a phylogenetic relationship with the TIR-NBS class of plant disease resistance genes[J]. Journal ofMolecular Evolution，2002，55（5）：595-605.

［17］Yue J X，Meyers B C.Tracingthe origin and evolutionary history of plant nucleotide-binding site-leucine-rich repeat（NBS-LRR）genes[J].NewPhytologist，2012，193（4）：1049-1063.

［18］Himmelreich R，Hilbert H，Plagens H，et al.Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae [J].Nucleic Acids Res，1996，24（22）：4420-4449.

［19］Martin G B，Frary A，Chunwongse J，et al.A member of the tomato Pto gene familyconfers sensitivitytofenthion resultingin rapid cell death[J].Plant Cell，1994，6（11）：1543-1552.

［20］Pamiske M，Hammond-Kosack KE，Golsten C，et al.Novel disease resistance specificities result from sequence exchange between tandemly repeated genes at the cf-4/9 locus of tomato[J].Cell，1997，91（6）：821-832.

［21］Wang G L，Ruan D L，Song W Y，et al.xa21D encodes a receptor-like molecule with a leucine-rich repeat domain that determines race-specific recognition and is subject toadaptive evolution [J].Plant Cell，1998，10（5）：765-779.

［22］Zhong Y，Yin H，Sargent D J，et al.Species-specific duplications driving the recent expansion of NBS-LRR genes in five Rosaceae species[J].BMCGenomics，2015，16（1）：1471-2164.

［23］宋霄，柏素花，戴洪义.苹果NBS-LRR1基因的鉴定与表达分析[J].园艺学报，2013，40（7）：1233-1243.

［24］杨慧，薛彦久，王莹莹.一个光敏色素B调控的水稻NBS-LRR基因的表达模式分析[J].山东农业科学，2011（6）：1-9.

［25］Wang X M，Chen J，Yang Y，et al.Characterization of a novel NBS-LRR gene involved in bacterial blight resistance in rice[J]. Plant Molecular BiologyReporter，2013，31（3）：649-656.

［26］Que Y X，Lin J W，Zhang J S，et al.Molecular cloning and characterisation of a non-TIR-NBS-LRR type disease resistance gene analogue fromsugarcane[J].Sugar Tech，2008，10（1）：71-73.

［27］Guo L J，Li M，Wang W J，et al.Over-expression in the nucleotide-binding site-leucine rich repeat gene DEPG1 increases susceptibility to bacterial leaf streak disease in transgenic rice plants[J].Molecular BiologyReports，2012，39（4）：3491-3504.

［28］He X F，FangY Y，FengL，et al.Characterization of conserved and novel microRNAs and their targets，including a TuMV-induced TIR-NBS-LRR class R gene-derived novel miRNA in Brassica[J]. FEESLett，2008，582（16）：2445-2452.

［29］KlevebringD，Street NR，Fahlgren N，et al.Genome-wide profiling ofpopulus small RNAs[J].BMCGenomics，2009，10：620-638.

［30］高树广，刘红彦，王俊美，等.芝麻NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与分析[J].河南农业科学，2011，40（9）：81-85.

［31］Ilag L L，Yadav R C，Huang N，et al.Isolation and characterization of disease resistance gene homologues from rice cultivar IR64[J]. Gene，2000，255（2）：245-255.

［32］张立荣，杨文香，刘大群.小麦NBS类抗病基因类似序列的多样性和进化关系研究[J].华北农学报，2011，26（4）：23-26.

［33］Liu Z J，Feng S，Pandey MK，et al.Identification of expidentification of expressed resistance gene analogs from peanut（Arachis hypogaea L.）expressed sequence tagss[J].Journal Integrative Plant Biology，2013，55（5）：453-461.

［34］Samuelian S K，Baldo A M.Isolation and linkage mapping of NBS-LRR resistance gene analogs in red raspberry（Rubus idaeus L.）and classification among 270 Rosaceae NBS-LRR genes[J]. Tree Genetics&Genomes，2008，4（4）：881-896.

［35］李海霞，张志毅，张谦，等.毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究[J].北京林业大学学报，2009，31（1）：73-78.

［36］郭立佳，毛倩，汪卫，等.一个NBS-LRR蛋白质基因转化水稻及其超量表达[J].厦门大学学报：自然科学版，2010，49（4）：552-557.

Classification，Evolution，Regulation and Application of NBS R-genes in Plants

LIUJing1，CHANGZhi-jian2，GUOHui-juan2，LI Xin2，ZHANGXiao-jun2，ZHANHai-xian2，RENYong-kang2，QIAOLin-yi1，2
（1.College ofGraduate，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Province KeyLaboratoryofCrop Genetics and Molecular Improvement，Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Nucleotide binding site（NBS）-encoding gene family,which contains the largest number of members,plays a critical role in plant resistance to pathogens and pests.In this review,we summarized the research progress of classification,function,number, evolution,expression and application ofNBSgenes in plant,and discussed the prospect ofresearch on them.

NBS;classification;evolution;regulation;application

Q943.2

A

1002-2481（2016）03-0423-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.37

2015-10-20

山西省科技攻关项目（20150311001-1）；山西省青年基金项目（2015021145）；山西省农业科学院攻关项目（15YGG01）；山西省农业科学院重点科研项目（YZD1501）

刘静（1991-），女，山西吕梁人，在读硕士，研究方向：种质资源创新与利用。乔麟轶为通信作者。