骨肉瘤组织中XIAP和NF-κB的表达变化及意义

张龙 ，王景峰，刘宝平，郑铁钢

(1 河北北方学院研究生部，河北张家口075000；2 中国人民解放军第二五一医院)



骨肉瘤组织中XIAP和NF-κB的表达变化及意义

张龙1，王景峰1，刘宝平2，郑铁钢2

(1 河北北方学院研究生部，河北张家口075000；2 中国人民解放军第二五一医院)

目的 观察X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)和核因子κB(NF-κB)在骨肉瘤组织中的表达变化，并探讨其临床意义。方法 收集36例骨肉瘤患者和20例骨软骨瘤患者的瘤组织，采用免疫组化SP法检测组织中XIAP和NF-κB的表达，并分析二者与骨肉瘤患者临床病理参数的关系，采用Spearman秩相关对二者进行相关分析。结果 骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中XIAP的阳性表达率分别为69.4%(25/36)和0(0/20)，NF-κB的阳性表达率分别为72.2%(26/36)和15.0%(3/20)。两者比较，P均<0.01。XIAP和NF-κB的表达与骨肉瘤患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及病理分型无关(P均>0.05),而与Enneking分期、分化程度、软组织侵犯及转移相关(P均<0.05)；XIAP和NF-κB在骨肉瘤组织中的表达呈正相关(r=0.396,P<0.05)。结论 XIAP和NF-κB在骨肉瘤组织中均表达升高，二者可能协同促进骨肉瘤的发生、发展及侵袭转移。

骨肉瘤；骨软骨瘤；X连锁的凋亡抑制蛋白；核因子κB

骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，以高度恶性的梭形基质细胞为特点，肿瘤细胞具有直接形成骨质或肿瘤样类骨质的能力。骨肉瘤好发于青少年，易侵及四肢长管状骨的干骺端，每年的发病率约为3/100万，是最常见的原发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤转移率及病死率非常高，早期转移是导致其预后差的重要因素。X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)和核因子κB(NF-κB)在多种恶性肿瘤中存在高表达，且与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关[1～4]。目前，关于XIAP和NF-κB在骨肉瘤中表达及其意义的研究鲜有报道。本研究采用免疫组化SP法检测了XIAP和NF-κB在骨肉瘤组织中的表达，并探讨了其与骨肉瘤患者临床病理资料的关系，分析了两者的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集中国人民解放军第二五一医院2005年1月～2016年1月手术穿刺或切除的骨肉瘤患者36例，男22例、女14例，年龄10～58岁、中位年龄27.0岁。另收集同期骨软骨瘤患者20例，男12例、女8例,年龄9～57岁、中位年龄26.2岁。56例患者均经过临床、病理、影像学三者结合确诊，均行手术治疗，标本采集前均未行任何放化疗，术中留取瘤组织，并制成蜡块。

1.2 组织中XIAP、NF-κB表达的检测方法 采用免疫组化SP法。组织标本用10%甲醛浸泡，石蜡包埋，常规厚4 μm连续切片，常规脱蜡、水化，灭活，微波热抗原修复，滴加封闭液，滴加稀释的浓缩型兔抗人XIAP(BIRC4)多克隆抗体和浓缩型兔抗人NF-κB p65(RELA)多克隆抗体(1∶50)(武汉博士德生物工程有限公司)，4 ℃冰箱过夜，室温下复温，滴加相应的HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(美国KPL公司);DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。用武汉博士德生物工程有限公司提供的已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断方法 XIAP以细胞质出现黄色或棕色颗粒作为阳性，NF-κB以细胞质和(或)细胞核出现黄色或棕色颗粒为阳性。染色标本均由中国人民解放军第二五一医病理科两位高年资病理医师用双盲法观察结果。根据细胞着色程度评分：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再根据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项得分相乘为最终结果：0为染色阴性，1～12为染色阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。样本率的比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法，相关性分析采用Spearman秩相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤和骨软骨瘤组织中XIAP和NF-κB的表达比较 XIAP阳性染色定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒性着色。XIAP在骨肉瘤和骨软骨瘤中的阳性表达率分别为69.4%(25/36)和0(0/20)，两组比较，P<0.01。NF-κB阳性染色主要定位于细胞质和(或)细胞核中，呈棕黄色颗粒性着色。NF-κB在骨肉瘤和骨软骨瘤中的阳性表达率分别为72.2%(26/36)和15.0%(3/20)，两组比较，P<0.01。

2.2 骨内瘤组织中XIAP和NF-κB表达与患者临床病理特征的关系 XIAP和NF-κB在骨肉瘤中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及病理分型无明显相关性(P均>0.05)，而与Enneking分期、分化程度、软组织侵犯及转移相关(P均<0.05)。见表1。

表1 XIAP和NF-κB表达与骨肉瘤临床病理参数的关系(例)

2.3 骨肉瘤组织中XIAP和NF-κB的相关性 骨肉瘤组织中XIAP和NF-κB共同阳性表达20例，共同阴性表达5例;XIAP阳性表达、NF-κB阴性表达5例;XIAP阴性表达、NF-κB阳性表达6例。XIAP和NF-κB的表达呈正相关(r=0.396,P<0.05)。

3 讨论

XIAP是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的一员，又称hILP、MIHA或BIRC4。XIAP基因定位于X染色体q24-25上，编码含有497个氨基酸、相对分子质量约为57 kD的蛋白质。XIAP是IAPs家族中作用最强的凋亡抑制因子，可通过多种途径参与细胞增殖和凋亡的调节、免疫调控及血管生成等过程[5,6]。XIAP在人体的正常组织内广泛存在且表达极低，但在多种恶性肿瘤中的表达显著增高。美国癌症研究所对60种人类肿瘤细胞系的研究[7]结果表明，XIAP在多数肿瘤细胞系中普遍高表达，且其表达水平与肿瘤细胞的抗凋亡能力呈正相关,提示其可能是评估肿瘤恶性程度及预后的一种有效指标。刘志英等[3]研究发现，乳腺浸润性导管癌组织中XIAP蛋白过表达，Caspase-3蛋白低表达甚至缺失。过表达的XIAP蛋白抑制了Caspase-3蛋白表达，从而阻止了细胞凋亡，并促使乳腺细胞恶性转化。邢旻琰等[8]研究发现，XIAP在骨肉瘤组织中的表达明显高于瘤旁正常组织，其表达与骨肉瘤患者的性别、年龄、肿瘤部位以及肿瘤大小无明显相关性，而与Enneking临床分期及预后不良相关,提示其对判断骨肉瘤患者的预后有一定的参考价值。Qu等[9]通过试验证实，XIAP在骨肉瘤组织中的阳性表达明显高于瘤旁非肿瘤组织，骨肉瘤组织中XIAP的表达水平与临床分期、肿瘤大小和转移相关；XIAP-siRNA能下调沉默骨肉瘤MG63系中XIAP的表达来抑制肿瘤细胞的增殖和分化，诱导细胞凋亡，阻滞细胞于G0/G1期，进而抑制骨肉瘤细胞的生长、提高骨肉瘤细胞对阿霉素及顺铂的化疗敏感性。本研究结果显示，XIAP在骨肉瘤中的阳性表达率显著高于骨软骨瘤，其表达与骨肉瘤的Enneking分期、分化程度、软组织侵犯及转移相关，与文献[8,9]报道类似，提示XIAP可能参与了骨肉瘤的发展、分化，对骨肉瘤的侵袭转移有促进作用。

NF-κB是1986年Sen等首次从成熟B淋巴细胞核提取物中发现的一种核蛋白，因其能与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因增强子B序列(GGGACTTTCC)特异结合而得名。NF-κB普遍存在于自然界大多数真核细胞中，且已被证实是一种具有多项转录调节作用的转录因子，在众多的病理生理过程中有着重要作用[10]。大量研究支持NF-κB在多种恶性肿瘤中高表达，且NF-κB在肿瘤的多个方面发挥关键作用[2]。陈增银等[4]报道，NF-κB p65在肝癌患者癌组织中表达明显升高，且NF-κB p65蛋白阳性表达与肝癌患者病理分级、淋巴结转移有关，它可能参与了肝癌的发生、发展。Neil等[11]研究发现，乳腺癌的疾病进展与NF-κB的活化密切相关。付文娟等[12]报道显示骨肉瘤组织NF-κB蛋白表达强度高于骨软骨瘤，且骨肉瘤中NF-κB蛋白表达与细胞凋亡指数之间呈负相关，它参与细胞凋亡的调控过程,可抑制骨肉瘤细胞凋亡,对骨肉瘤发生、发展起促进作用。Tomonaga等[13]基于NF-κB活化研究表明，线性泛素化修饰介导的NF-κB活化在骨肉瘤的侵袭转移过程中起着重要作用。Yan等[14]新研究证实，非折叠蛋反应能活化NF-κB信号转导通路，进而使骨肉瘤细胞耐受顺铂诱导的细胞凋亡。本研究结果显示，NF-κB在骨肉瘤中的阳性表达率亦显著高于骨软骨瘤，并与骨肉瘤的Enneking分期、分化程度、软组织侵犯及转移相关，与文献[12～14]报道基本一致，提示NF-κB参与了骨肉瘤发生、发展及侵袭转移过程。

本研究结果还显示，XIAP和NF-κB在骨肉瘤组织中的表达呈正相关，提示XIAP和NF-κB在骨肉瘤发生、发展、侵袭生长及远处转移中可能起协同作用，其可能机制如下：XIAP是NF-κB的激活子，NF-κB的活化和释放，导致相应的抑制细胞凋亡的基因表达[11,15]；NF-κB是一种普遍存在的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，参与多种相关基因的转录调控，XIAP是NF-κB应答基因，NF-κB介导的抗凋亡活性与其上调XIAP的表达有关[16]。其中涉及的具体机制尚不明确，有待更深一步的研究证实。

综上所述，XIAP和NF-κB在骨肉瘤的发生、发展及侵袭转移过程中扮演重要角色，而且二者具有相互协同作用。XIAP与NF-κB有望成为判断骨肉瘤恶性程度及预后的有效指标。

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