膀胱尿路上皮癌组织中ING4、p53、Ki-67蛋白的表达变化及意义

张萌，伍季，夏中友，李云祥，范俊

(1川北医学院，四川南充63700；2 南充市中心医院)



·临床研究·

膀胱尿路上皮癌组织中ING4、p53、Ki-67蛋白的表达变化及意义

张萌1，伍季2，夏中友2，李云祥2，范俊2

(1川北医学院，四川南充63700；2 南充市中心医院)

目的 探讨膀胱尿路上皮癌组织中生长抑制因子4(ING4)、p53、Ki-67蛋白的表达变化及意义。方法 采用免疫组化法分别检测60例份膀胱尿路上皮癌组织、60例份癌旁组织、37例份膀胱正常黏膜组织中ING4、p53、Ki-67蛋白的表达，并分析其与膀胱癌患者病理分级、临床分期及临床资料的关系。Spearman 等级相关分析癌组织中三者的相关性。结果 膀胱尿路上皮癌组织、癌旁组织及膀胱正常黏膜组织ING4蛋白的阳性表达率分别为70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53的阳性表达率分别为96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、2.7%(1/37)，与膀胱尿路上皮癌组织比较，膀胱正常黏膜组织和癌旁组织中ING4蛋白阳性表达率高，p53、Ki-67蛋白阳性表达率低(P均<0.05)。ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表达与病理分级及临床分期有关(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白表达与病理分级、临床分期及肿瘤的发病个数有关(P均<0.05)。 ING4与p53、Ki-67蛋白呈负相关(rs分别为-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53与Ki-67蛋白呈正相关(rs=0.625，P<0.05)。结论 膀胱尿路上皮癌组织中ING4蛋白水平降低，p53和Ki-67蛋白水平升高，其均参与癌的发生、发展。

膀胱尿路上皮肿瘤；生长抑制因子4；p53；Ki-67蛋白

膀胱癌在全世界属于第五大常见恶性肿瘤，约占全部恶性肿瘤的3.2%，在我国其发病率位居泌尿系肿瘤首位，男性患病率是女性患病率的3～4倍，发病年龄主要处于50～70岁[1]。75%～85%的膀胱尿路上皮癌属于非肌层浸润性膀胱癌，其他为肌层浸润性和转移性癌[2]。尿路上皮癌从形态上和遗传学上是多样化的肿瘤，拥有不同的癌细胞系和特定的细胞结构改变[3]。近年虽然许多肿瘤标记物相继用于膀胱癌的预后判断, 但迄今为止尚无可供临床常规使用的肿瘤标记物。为寻找新的肿瘤标记物，本研究观察了ING4、p53、Ki-67在膀胱尿路上皮癌组织中的表达变化，并探讨了其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集川北医学院附属医院和南充市中心医院2014～2015年经手术切除的并有完整临床资料的膀胱尿路上皮癌组织60 例份, 其中患者男43例、女17例, 年龄45～80岁、平均61岁，年龄﹥60岁31例、≤60岁29例。癌旁组织60例份，均取自患者距离癌组织边缘约2 cm以上的正常膀胱黏膜组织。病理分级按世界卫生组织2004年标准确定, 低级别29例、高级别31例。临床病理分期按国际抗癌联盟TNM分期标准确定,非肌层浸润性膀胱癌(Tis～T1)28例、肌层浸润性膀胱癌(T2～T4)32例。膀胱正常黏膜组织37例份是通过膀胱切开取石及开放前列腺切除术所收集。患者男23例、女7例。

1.2 组织ING4、p53、Ki-67蛋白相对表达的检测 采用免疫组化SP法。鼠抗人p53 IgG单克隆抗体、鼠抗人Ki-67核抗原、免疫组织化学染色SP试剂、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物制品有限公司,鼠抗人ING4多克隆抗体购自英国Abcam公司，按试剂盒说明书操作。以扁桃体腺体切片作Ki-67的阳性对照；以直肠癌切片作p53的阳性对照；以睾丸切片作ING4的阳性对照；用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,作阴性对照。

1.3 结果判定 由2位病理科主任医师在临床和病理资料不知晓的情况下独立观察切片,并进行染色评分。使用半定量的评分系统来评估抗体的染色效果，计数5个高倍视野或500个细胞。ING4阳性表达为细胞核和(或)胞质内出现棕黄色颗粒；p53 阳性表达为细胞核出现棕黄色颗粒；Ki-67阳性表达为细胞核内出现棕黄色颗粒。按染色强度计分:0 分为无色，1分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色；按阳性细胞所占百分比计分：0 分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2 分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数>75%；染色强度与阳性细胞所占百分比乘积得染色系数：0～2为-，≥3为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。等级资料的两样本比较采用秩和检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ING4、p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜组织中的相对表达 膀胱尿路上皮癌、癌旁和膀胱正常黏膜组织中，ING4蛋白的阳性表达率分别为70.0%(42/60)、100%(60/60)、97.2%(36/37)，p53蛋白的阳性表达率分别为96.7%(58/60)、13.3%(8/60)、13.5%(5/37)，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为91.7%(55/60)、11.7%(7/60)、 2.7%(1/37)，与膀胱尿路上皮癌组织比较，膀胱正常黏膜组织和癌旁组织中ING4蛋白阳性表达率高，p53、Ki-67蛋白阳性表达率低(P均<0.05)。在膀胱正常黏膜组织与癌旁组织中，ING4、p53、Ki-67蛋白阳性表达率比较，P均>0.05。

2.2 ING4、p53、Ki-67蛋白表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系 ING4蛋白在膀胱尿路上皮癌的表达与患者的性别、年龄、初发、复发以及肿瘤的大小、位置、个数无相关性(P均>0.05)，与病理分级及临床分期有关(P均<0.05)；p53和Ki-67蛋白与病理分级、临床分期及肿瘤的发病个数有关(P均<0.05)，与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、初发或复发均无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 膀胱尿路上皮癌组织中ING4、p53、Ki-67蛋白三者之间的相关性 ING4与p53、Ki-67蛋白呈负相关(rs分别为-0.301、-0.315，P均<0.05)；p53与Ki-67蛋白呈正相关(rs=0.625，P<0.05)。

3 讨论

ING4基因是近年发现的一种新的肿瘤抑制基因，为第2类肿瘤生长抑制因子家族的一员，由Shiseki等[4]在2003年发现并从人脑垂体中被分离出来。该基因定位于染色体12p13-31区域内，由8个外显子和7个内含子组成，基因跨距13 kb。ING4基因编码蛋白包括一个具有高度保守的植物同源结构域和一个核定位信号(NLS)区[5]。文献报道，ING4基因在许多肿瘤中如胶质瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、头颈部的鳞状上皮细胞癌、恶性黑色素瘤、肝细胞癌等中起抑制作用。随着对ING4研究的进一步深入，人们发现ING4具有的功能包括增强p53活性，维持细胞间的接触性抑制，抑制肿瘤侵袭转移、低氧诱导因子的活性，参与组蛋白乙酰化，抑制肿瘤生长、新生血管形成，影响细胞周期，促进细胞凋亡、细胞自噬，增强肿瘤对化疗药物的敏感性[6,7]。但是有关ING4基因在膀胱癌组织中研究的文献不多。本试验结果提示，ING4基因在膀胱尿路上皮癌组织中的表达量下降，并随着肿瘤病理级别或临床分期的升高其表达水平下降，而ING4蛋白在正常组织、癌旁组织的阳性表达率明显高于癌组织，这说明ING4蛋白表达水平的下降与膀胱尿路上皮癌的发生、发展有密切关系，也提示ING4蛋白在膀胱癌的发生发展中起抑制作用。

表1 ING4、p53、Ki-67蛋白表达与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的关系(例)

p53作为抑癌基因在抑制肿瘤的发生过程中发挥着重要作用。p53通过调节相关靶基因如p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIP1、PAG608、HER2、PCNA、cyclin G等从而发挥调节细胞周期、细胞凋亡、细胞分化、DNA损伤、血管生成和转移的抑制及其他功能[8]。许多实验证实在不同恶性肿瘤中，p53与高级的病理分级、临床分期、不良预后、复发、病死率均存在一定的相关性[9]。本研究发现，随着肿瘤临床分期、病理分级越高以及肿瘤个数的增多，p53蛋白阳性表达率越高。ING4基因能够通过增强p53的作用从而起到激活细胞凋亡、影响细胞周期的作用，其机制可能是ING4蛋白的NLS转录的氨基酸蛋白能参与p53活化后的四聚化、细胞内定位及调节p53蛋白转录，同时ING4的NLS区域能与p53结合，进而增强p53蛋白活性和提高p53的甲基化。

Ki-67是一种增殖相关性核抗原,在细胞周期中的G1、S、G2和M期中均有合成，其可准确反映细胞增殖状况。一些研究报告提示，Ki-67的增殖系数能够作为单独因素来评估肿瘤的病理分级、临床分期、预后、复发等，并且Ki-67在肿瘤中的过表达与肿瘤的侵袭性存在密切关系。本研究结果显示，Ki-67蛋白随着肿瘤临床分期、病理分级越高以及肿瘤个数的增多，Ki-67蛋白阳性表达率增高。Nanding等[10]在胃肠道间质瘤发现，ING4蛋白随着肿瘤的分级升高，其表达呈下降趋势，并与Ki-67蛋白呈负相关，其结果显示两者与肿瘤的进展、转移及预后具有负相关性。本试验中也观察到ING4和Ki-67蛋白与肿瘤的病理分级或临床分期有关，这表明ING4及Ki-67蛋白与膀胱癌的发生发展及侵袭性有关，但ING4与Ki-67蛋白之间的具体作用机制仍不清楚。

任何单一肿瘤标记物都不能全面准确地反映肿瘤的恶性潜能，更无法完全预测其预后。膀胱癌的发生、发展是多因素、多基因影响的复杂过程，联合检测ING4、p53及Ki-67可能对膀胱癌的早期诊断、精准治疗及预测预后提供一定的帮助。本试验结果显示随着肿瘤的病理分级或临床分期升高，ING4与p53、Ki-67蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达呈负相关性，提示ING4基因在抑制膀胱癌发生发展过程中发挥着重要的作用，并且联合检测膀胱尿路上皮癌中ING4、p53及Ki-67蛋白表达有一定的临床意义,这不但有利于揭示膀胱癌发生发展、浸润转移的机制, 也能作为评价患者预后的参考指标。

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[10] Nanding A, Tang L, Cai L, et al. Low ING4 protein expression detected by paraffin-section immunohistochemistry is associated with poor prognosis in untreated patients with gastrointestinal stromal tumors[J]. Gastric Cancer, 2014,17(1):87-96.

四川省教育厅科研项目(13EA0226)。

伍季(E-mail：wuji2168@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.017

R737.14

B

1002-266X(2016)45-0054-03

2016-08-12)