子痫前期体外缺氧细胞中Nrf2和NQO1的表达变化

张展，周洁，宋婉玉，李爱萍，常爱民

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)



子痫前期体外缺氧细胞中Nrf2和NQO1的表达变化

张展，周洁，宋婉玉，李爱萍，常爱民

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

目的 探讨子痫前期体外缺氧细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)和醌氧化还原酶1(NQO1)的表达水平及定位变化。方法 选取绒癌JAR细胞株，以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。取对数生长期细胞，贴壁后分组培养。对照组：按照之前的条件继续培养24 h；马来酸二乙酯(DEM)组用含50 μmol/L DEM的培养基在20% O2培养箱中继续培养24 h；子痫前期体外模型组(缺氧组)：将贴壁后的细胞置于1% O2培养箱中继续培养24 h。采用实时荧光定量PCR法、蛋白质免疫印迹法分别检测JAR细胞中Nrf2 mRNA及蛋白和NQO1 mRNA及蛋白的表达水平；采用细胞免疫荧光法检测各组JAR细胞中Nrf2蛋白定位情况。结果 与对照组比较，DEM组Nrf2和NQO1 mRNA及蛋白表达升高，缺氧组Nrf2和NQO1 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05或<0.01)。细胞免疫荧光结果显示，DEM组中Nrf2蛋白在JAR细胞核中表达较密集，而缺氧组细胞核中只有少量表达。结论 子痫前期体外缺氧细胞中Nrf2及其目的基因NQO1表达水平降低，以细胞核中的表达降低为著。

子痫前期；缺氧；核因子E2相关因子2；醌氧化还原酶1

子痫前期(PE)是妊娠期20周后出现收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或随机尿蛋白+[1]，是围产期妇女及新生儿死亡的主要原因。目前认为氧化应激参与了PE发病。已有研究证实，PE患者的胎盘组织和母体循环中均存在过度氧化应激，但具体机制仍不明确[2]。核因子E2相关因子2(Nrf2)是抵御氧化应激的重要转录因子。在正常(非应激)状态下，Nrf2大多与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合于胞质中。当处于氧化应激状态下，Nrf2与Keap1解离，在胞核中累积，激活其下游的抗氧化应激因子，其中包括醌氧化还原酶1(NQO1)[3]。本课题组已证实，在正常妊娠孕妇及PE患者胎盘组织中Nrf2和NQO1均有不同程度的表达[4]。另外，有文献报道Nrf2下游因子HO-1、GCLC、GCLM在PE胎盘组织中的表达也有所降低[5]。2015年10月～2016年5月，本研究通过观察正常或缺氧条件下以及加入马来酸二乙酯(DEM)后Nrf2和NQO1在滋养细胞JAR中的表达水平以及Nrf2的表达定位情况，探讨不同条件下JAR细胞中Nrf2和NQO1的表达变化及与PE的潜在关系。

1 材料与方法

1.1 材料 绒癌JAR细胞株购于美国ATCC公司；DEM购自上海阿拉丁公司；RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒购自日本东洋纺公司；蛋白浓度BCA试剂盒购自北京康为公司；兔抗人Nrf2多克隆抗体购自美国Santa公司；鼠抗人NQO1多克隆抗体购自美国CST公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司；引物序列设计与合成均由上海生工公司完成。

1.2 细胞培养及分组 JAR细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5% CO2、20% O2培养箱中培养。实验时，取对数生长期细胞用胰酶消化，重悬后将2×105细胞接种在六孔板上，贴壁后对细胞进行以下分组培养：对照组：按照之前的条件继续培养24 h；DEM组：用含50 μmol/L DEM的培养基在20% O2培养箱中继续培养24 h；PE体外模型组(缺氧组)：将贴壁后的细胞置于1% O2培养箱中继续培养24 h。

1.3 JAR细胞中Nrf2、NQO1 mRNA相对表达的检测 采用实时荧光定量PCR法。JAR细胞的总RNA按试剂盒方法提取，用Nano-2000分光光度计(A260/280)测定RNA浓度；按照cDNA合成试剂盒进行逆转录；荧光定量PCR总反应体系为15 μL；反应引物序列：Nrf2上游引物为5′-ACTACTCCCAGGTTGCCCA-3′，下游引物为5′-GAACAAGTGACTGAAACGTAGCC-3′；NQO1上游引物为5′-GAAAGGCTGGTTTGAGCGAG-3′，下游引物为5′-GTGGATCCCTTGCAGAGAGT-3′；β-actin mRNA作为内参基因，上游引物为5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGAAG-3′，下游引物为5′-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3′。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40个循环，记录熔解曲线及CT值，扩增产物4 ℃保存；采用2-ΔΔCT方法计算Nrf2、NQO1 mRNA的相对表达量。

1.4 JAR细胞Nrf2、NQO1蛋白相对表达的检测 采用蛋白质免疫印迹法。用含有PMSF的细胞裂解液RIPA提取JAR细胞中总蛋白，蛋白浓度用BCA试剂盒检测；采用5%浓缩胶和12%分离胶以进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白上样量为20 μg；使用湿式转膜仪将凝胶中的蛋白转至硝酸纤维素膜；使用含5%脱脂奶粉的TBST 液封闭后加入Nrf2、NQO1和内参β-actin的一抗4 ℃孵育过夜后，加入二抗孵育，洗脱二抗后用Odyssey双色红外激光成像系统扫描并分析蛋白条带灰度值。

1.5 Nrf2蛋白细胞内定位检测 采用细胞免疫荧光法。室温下，4%的多聚甲醛固定爬好细胞的玻片15 min后用PBS洗涤3次；0.2% Triton X-100室温通透10 min洗涤后用山羊血清室温封闭，接着加入Nrf2的一抗放入湿盒内4 ℃孵育，过夜后加入二抗室温孵育；滴加DAPI避光孵育染核后，使用荧光倒置显微镜观察蛋白定位情况。

2 结果

2.1 3组Nrf2和NQO1mRNA及蛋白相对表达量的比较 与对照组比较，DEM组Nrf2、NQO1mRNA及蛋白升高，缺氧组降低(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 3组Nrf2和NQO1 mRNA及蛋白的相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 JAR细胞中Nrf2蛋白的定位情况 在相同的激发强度及条件下，Nrf2在各组JAR细胞中均呈阳性表达，且胞质、胞核中皆有表达。对照组中可见绿色荧光在JAR细胞质和胞核中均匀分布；DEM组中，胞质有表达，但是胞核中表达更密集；缺氧组中绿色荧光表达变弱，且胞核中只有少量表达。

3 讨论

正常妊娠与子宫内环境的适应性改变有关，其根据胎儿必要的需求暂时改变了子宫内氧含量、代谢和免疫状态。孕早期，胎儿在相对低氧的环境中发育，即氧分压为17 mmHg(约2.4% O2)[6], 该环境能够确保足够的绒毛外滋养细胞侵袭入母体蜕膜以及适当的胎盘血管化和血管生成，以维持母体胎盘之间的正常血液循环。PE滋养细胞侵袭能力下降和子宫胎盘灌注不足导致胎盘氧化与抗氧化作用失衡，出现氧化应激。本次研究选用的JAR细胞来源于绒癌细胞，与胎盘滋养细胞有许多共同特征，1% O2条件下培养该细胞株作为PE的体外缺氧模型已经应用于多项研究[7，8]。

Nrf2是cap′n′collar(CNC)转录因子家族中一种强有力的转录激活因子，具有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，能与抗氧化反应元件(ARE)结合，在氧化应激和电应力诱导的多种细胞保护基因表达中起着重要作用。ARE是在多种Ⅱ相解毒酶及氧化-还原平衡蛋白的基因启动子中发现的一种顺式调节因子。正常情况下，Nrf2与其负性调节因子Keap1结合，后者可通过快速蛋白酶体降解而负性调节Nrf2。在氧化应激或亲电体存在情况下，Nrf2停止降解。稳定的Nrf2在胞核积聚并与小maf蛋白偶联，通过与ARE序列相互作用，激活目的基因，发挥保护细胞的作用[9]。NQO1即是其激活的目的基因之一。NQO1是一种专性双电子还原酶，是两个相互缠绕的残基单体组成的同源二聚体。作为一种氧化代谢酶，NQO1不仅可以将内源性和外源性醌类成为氢醌类，避免有毒的半醌自由基中间体的形成，还可以激活泛醌和维生素e醌构成的抗氧化剂，对抗氧化应激。另外，NQO1也可通过清除过氧化物而发挥保护细胞的作用[10]。NQO1在上皮细胞、血管内皮细胞的胞质和人体多种组织中广泛表达。本课题组已经证实重度PE患者胎盘组织中Nrf2和NQO1的表达水平低于正常胎盘组织，胎盘氧化应激增强，其原因可能是Nrf2功能被抑制，使得其目的基因NQO1活化降低，抗氧化能力减弱[4]。

本研究结果显示，加入Nrf2特异性激动剂后，Nrf2和NQO1 mRNA和蛋白的表达水平均有显著升高，表明与其他细胞和人体组织中相同，在JAR细胞中NQO1同样受Nrf2调控；缺氧组中Nrf2的活化由于低氧而受到了抑制，该结果与本课题组在PE胎盘组织中得到的结果理论意义上相符，并与Chigusa等[5]众多学者的研究结果一致。迄今为止，有关Nrf2的活化抑制因素所知甚少。已有研究证实，在JAR细胞中，促进Nrf2降解和蛋白表达的Keap1不受缺氧环境的影响，表明在缺氧环境下Keap1与Nrf2的抑制无关[5]。本研究结果显示，与对照组相比，缺氧组中Nrf2在胞核中低表达，可能是缺氧抑制了Nrf2在胞核中的积聚使得与小maf蛋白偶联的Nrf2减少，与ARE序列相互作用减弱，以至于不能正常激活其目的基因，发挥其保护细胞的作用。

综上所述，与正常妊娠生理性缺氧相比，PE胎盘组织水平及体外细胞水平试验均说明，缺氧可能抑制了Nfr2入核，使其无法正常激活下游的目的基因，抗氧化能力减弱，发生氧化应激。氧化应激可导致胎盘释放包括炎症细胞因子、抗血管生成因子、凋亡碎片在内的一系列因子，加剧母体炎症反应和内皮细胞损伤，与PE的发病密切相关。因此，Nrf2的功能抑制可能参与了PE的发生发展，两者也可能互为因果关系。然而，PE以及缺氧环境下滋养细胞Nrf2抑制表达的详细机制还未明确，仍需进一步探索。

[1] 谢幸,苟文丽．妇产科学[M]．8版．北京：人民卫生出版社，2013：90-97．

[2] Jauniaux E, Burton GJ. The role of oxidative stress in placental-related diseases of pregnancy[J]. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris), 2016,45(8):775-785.

[3] Baird L, Dinkova-Kostova AT. The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J]. Arch Toxicol, 2011,85(4):241-272.

[4] 张展,赵小辰,冯杨,等.重度子痫前期患者胎盘组织中Nrf2和NQO1的表达[J].中国妇幼保健,2016,31(6):1142-1144.

[5] Chigusa Y, Kawasaki K, Kondoh E, et al. Simvastatin inhibits oxidative stress via the activation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 signaling in trophoblast cells[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2016,42(1):36-43.

[6] Rodesch F, Simon P, Donner C, et al. Oxygen measurements in endometrial and trophoblastic tissues during early pregnancy[J]. Obstet Gynecol, 1992,80(2):283-285.

[7] Plosch T, Gellhaus A, van Straten EM, et al. The liver X receptor (LXR) and its target gene ABCA1 are regulated upon low oxygen in human trophoblast cells: a reason for alterations in preeclampsia[J]. Placenta, 2010,31(10):910-918.

[8] Valbuena-Diez AC, Blanco FJ, Oujo B, et al. Oxysterol-induced soluble endoglin release and its involvement in hypertension[J]. Circulation, 2012,126(22):2612-2624.

[9] Itoh K, Mochizuki M, Ishii Y, et al. Transcription factor Nrf2 regulates inflammation by mediating the effect of 15-deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin j(2)[J]. Mol Cell Biol, 2004,24(1):36-45.

[10] Nioi P, Hayes JD. Contribution of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 to protection against carcinogenesis, and regulation of its gene by the Nrf2 basic-region leucine zipper and the arylhydrocarbon receptor basic helix-loop-helix transcription factors[J]. Mutat Res, 2004,555(1-2):149-171.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.014

R714.2

A

1002-266X(2016)45-0045-03

2016-08-16)