白细胞介素37对食管癌细胞增殖、迁移、炎症反应的影响及其机制

刘良忠,李小红,马楼艳,胡建蛾,张力,邓超,李刚,张军

(1重庆三峡中心医院，重庆404000；2西安市第九医院)



·基础研究·

白细胞介素37对食管癌细胞增殖、迁移、炎症反应的影响及其机制

刘良忠1,李小红1,马楼艳2,胡建蛾1,张力1,邓超1,李刚1,张军1

(1重庆三峡中心医院，重庆404000；2西安市第九医院)

目的 探讨白细胞介素37(IL-37)对食管癌细胞增殖、迁移、炎症反应的影响及其可能的分子机制。方法 用不同浓度(0、10、50、100 ng/mL)的重组IL-37蛋白分别处理食管癌细胞Eca-109和TE-1 24、48、72 h，MTT法检测其对细胞增殖率的影响；用100 ng/mL的重组人IL-37蛋白(IL-37组)干预两种细胞株，对照组加入等量培养基，24 h后Transwell侵袭小室试验检测迁移细胞数目，流式细胞术检测细胞凋亡率，RT-PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1β和IL-6的表达，Western blotting法检测pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3的表达；两种细胞株分别转染pcDNA3.1空质粒(对照组)、pcDNA3.1-IL-6质粒(IL-6组)，IL-6+IL-37组转染pcDNA3.1-IL-6质粒24 h后换含100 ng/mL重组人IL-37蛋白的培养基培养24 h,检测TNF-α、IL-1β、IL-6、pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3的表达。结果 与其他浓度相比，100 ng/mL IL-37对细胞增殖具有明显的抑制效果(P均<0.05)。Eca-109和TE-1细胞中，与对照组相比，IL-37组中的迁移数目均明显减少，凋亡率均明显增加(P均<0.05)。IL-37组中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA,pSTAT3 Y705、Bcl-2蛋白表达均降低(P均<0.05)，Caspase-3的表达增加(P均<0.05)。与对照组及IL-37+IL-6组比较，IL-6组pSTAT3Y 705和Bcl-2蛋白的表达增加，Caspase-3蛋白表达降低(P均<0.05)。结论 IL-37能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移及炎症反应，并促进细胞凋亡，这些作用可能是通过IL-6/STAT3信号通路发挥作用。

食管肿瘤；白细胞介素37；细胞增殖；炎症；IL-6/STAT3信号通路

食管癌是全球最常见的恶性肿瘤，尽管目前该疾病在治疗方法上有了很大进展，但是仍有超过40%的食管癌患者术后出现复发[1]，因此迫切需要探索新的治疗药物。白细胞介素37(IL-37)是最新发现的IL-1家族的一员，是先天性免疫反应和获得性免疫反应的抑制剂。已经发现，IL-37在结肠炎[2]、关节炎、银屑病[3]等炎症性疾病中表现出明显的抗炎作用。近年研究发现，IL-37也具有明显的抗肿瘤活性[4, 5]，但是IL-37在食管癌中的作用及机制还不清楚。2016年1月～2016年7月，本文进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞株Eca-109和TE-1购自美国ATCC公司，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰酶购自美国Gibco公司，MTT购自美国Sigma公司，AnnexinV: FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司，NanoFectin转染试剂购自上海依科赛生物制品有限公司，RNAisoPlus试剂购自大连宝生物公司，SYBR RT-PCR试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司，RIPA裂解液、PMSF和结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司，重组人IL-37蛋白购自美国R&D公司，BCA法蛋白定量试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，Anti-信号转导子与转录活化子3 (STAT3) (phospho Y705)抗体(1∶200 000)、Anti-Bcl-2抗体(1∶1 000)和Anti-active Caspase-3抗体(1∶500)购自英国Abcam公司。Anti-β-actin抗体和Goat Anti-rat IgG/HRP抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 细胞培养、分组及处理 Eca-109和TE-1细胞均培养在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中，待细胞长至90%左右时胰酶消化传代。首先用不同浓度(0、10、50、100 ng/mL)的重组人IL-37蛋白处理两种细胞，检测其对细胞增殖活力的影响。将部分细胞随机分成对照组和IL-37组，IL-37组用指定浓度的重组人IL-37蛋白处理，对照组加入等量的培养基，检测IL-37对细胞迁移、凋亡和炎性细胞因子表达的影响。将另一部分细胞随机分成对照组、IL-6组和IL-37+IL-6组，Eca-109和TE-1细胞接种到6孔板中，待细胞融合度达到60%左右时，对照组转染pcDNA3.1空质粒；IL-6组及IL-37+IL-6组用NanoFectin转染试剂转染pcDNA3.1-IL-6质粒；转染24 h，IL-37+IL-6组换成含有100 ng/mL重组人IL-37蛋白的培养基，继续培养24 h，检测各组中相关蛋白表达情况。

1.3 食管癌细胞增殖活力的测算 采用MTT法。取对数生长期Eca-109和TE-1细胞，按照1×103/孔的密度分别接种于96孔板中，加入不同浓度(0、10、50、100 ng/mL)的重组人IL-37蛋白分别培养24、48、72 h后，换成含有500 μg/mL MTT的新鲜培养基继续培养5 h，弃上清，加入异丙醇溶解甲臜晶体，然后在570 nm条件下测定吸光值。

1.4 食管癌细胞迁移能力的检测 采用Transwell侵袭小室试验。将Transwell小室放入24孔板中，上室加入100 μL无血清的DMEM培养基，含2×105个细胞；下室加入600 μL含有100 ng/mL重组人IL-37蛋白的完全培养基，常规培养24 h后，取出小室，倒掉小室中的培养基，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS漂洗3遍，显微镜下随机选取6个视野进行计数，计算每个视野中平均迁移细胞数目。

1.5 食管癌细胞凋亡率的检测 使用流式细胞术。将两种食管癌细胞按照1×106/孔的密度分别接种到6孔板中，培养24 h后，换成含有100 ng/mL重组人IL-37蛋白的DMEM培养基，继续常规培养24 h，按照AnnexinV:FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书操作，在FACSCalibur流式细胞仪上检测凋亡细胞。计算细胞凋亡率。

1.6 食管癌细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相对表达量检测 采用RT-PCR法。按照RNAisoPlus说明书操作，提取细胞总RNA。取2 μg总RNA进行逆转录，然后按照RT-PCR试剂盒说明书操作，以β-actin为内参，按照2-ΔΔCt的方法计算细胞中 TNF-α、IL-1β和IL-6的相对表达量。引物序列：IL-1β上游5′TATAGCCTGGACTTTCCTGTT3′，下游5′GCTGACTGTCCTGGCTGATG3′；IL-6：上游5′CCTCCAGAACAGATTTGAG3′，下游5′ATTTGTGGTTGGGTCAGG3′；TNF-α：上游5′GCCGCATCGCCGTCTCCTAC3′，下游5′CCTCAGCCCCCTCTGGGGTC3′；β-actin：上游5′GCAAATGCTTCTAGGCGGAC3′，下游5′GCTGTCACCTTCACCGTTCC3′。

1.7 IL-37及IL-6对Eca-109和TE-1细胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 采用Western blotting法。细胞用冰冷的无菌PBS清洗2遍，加入100 μL RIPA裂解液(含10 mmol/L PMSF)充分裂解细胞，4 ℃、12 000 g离心15 min收集上清液，即为总蛋白。BCA法测定总蛋白的浓度后，每孔取总蛋白40 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，加入提前稀释好的一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次，加ECL发光液，充分覆盖膜后拍照并进行灰度值分析。

2 结果

2.1 不同时间不同浓度IL-37对食管癌细胞增殖活力的影响 重组IL-37蛋白以时间剂量依赖的方式抑制Eca-109和TE-1细胞的生长(P均<0.05)。

注：与对照组相比，*P<0.05。

图1 不同浓度的IL-37对Eca-109和TE-1细胞增殖的影响

2.2 IL-37对食管癌细胞迁移力及细胞凋亡率的影响 Eca-109细胞中,对照组、IL-37组细胞迁移数分别为119.83±6.24、44.00±4.94个/视野，凋亡率分别为8.29%±0.85%、35.44%±2.97%；TE-1细胞中分别为 151.50±9.38、31.83±8.26个/视野，3.16%±0.98%、45.26%±3.21%。与对照组相比，Eca-109和TE-1细胞IL-37组中的迁移数目均明显减少，凋亡率均明显升高(P均<0.05)。

2.3 IL-37对Eca-109和TE-1细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果见图2。与对照组相比，两种细胞IL-37组中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达均明显降低(P<0.05)。

注：与对照组相比，*P<0.05。

图2 IL-37对Eca-109和TE-1细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响

2.4 IL-37对Eca-109和TE-1细胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 Eca-109细胞中，对照组、IL-37组pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3相对表达量分别为0.68±0.14、0.49±0.07、0.02±0.01，0.11±0.05、0.19±0.06、0.83±0.07；TE-1细胞中分别为0.74±0.05、0.54±0.07、0.04±0.05，0.26±0.03、0.30±0.04、1.25±0.07。Eca-109和TE-1细胞中，与对照组比较，IL-37组pSTAT3 Y705与Bcl-2的表达均降低，Caspase-3的表达增加(P均<0.05)。

2.5 IL-37及IL-6对Eca-109和TE-1细胞中pSTAT3 Y705、Bcl-2 和Caspase-3蛋白表达的影响 Eca-109细胞中，对照组pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3分别为0.56±0.07、0.37±0.09、0.12±0.04，IL-6组分别为1.55±0.13、1.61±0.16、0.02±0.02，IL-37+IL-6组分别为0.82±0.65、0.56±0.07、0.15±0.03。与对照组及IL-37+IL-6组比较，IL-6组pSTAT3Y 705和Bcl-2的表达增加，Caspase-3表达降低(P均<0.05)；TE-1细胞中，对照组pSTAT3 Y705、Bcl-2、Caspase-3分别为0.77±0.08、0.64±0.07、0.17±0.05，IL-6组分别为1.47±0.09、1.33±0.08、0.05±0.03，IL-37+IL-6组分别为0.91±0.05、1.02±0.10、0.25±0.07。与对照组及IL-37+IL-6组比较，IL-6组pSTAT3Y 705和Bcl-2蛋白的表达增加，Caspase-3蛋白表达降低(P均<0.05)。

3 讨论

IL-37被认为是先天性免疫反应的天然抑制剂，炎性组织中高表达的IL-37可抑制过多的炎症反应[5]。近年IL-37的抗肿瘤活性也逐渐被发现。研究显示，瘤内注射腺病毒介导的IL-37能够抑制小鼠肺纤维瘤生长[6]。IL-37还可以抑制肝癌、肾癌[4]、宫颈癌[7]和非小细胞肺癌等癌症进程，但是IL-37在食管癌中的作用还不清楚。

本研究结果显示，IL-37能够抑制食管癌细胞Eca-109和TE-1的增殖，并且具有剂量依赖性，同时IL-37还可以抑制两种细胞迁移，并促进细胞凋亡。肿瘤相关性炎症被认为是肿瘤的第七个特征，在肿瘤微环境中，过多的炎症能够促进肿瘤细胞增殖、血管生成、细胞转移,破坏获得性免疫反应，还可以减少细胞对激素和化学治疗药物的反应[8]。细胞因子在炎症过程中发挥着重要作用，因此我们探究了IL-37对细胞因子表达的影响。TNF-α是与炎症和免疫密切相关的一个细胞因子，它能够促进肿瘤的生长和转移，从而加速肿瘤形成[9]。IL-1β在包括食管癌在内的多种肿瘤中的表达增加，它能够促进肿瘤的增殖、转移和药物耐受[10]。IL-6是参与炎症相关肿瘤形成中的一个主要促炎因子，在食管癌中它与血管生成、上皮细胞间质化和不良预后有关。Leu等[11]的研究还发现IL-6能够抑制星孢菌素诱导的食管癌细胞凋亡。本研究结果显示，重组IL-37蛋白能够降低Eca-109和TE-1食管癌细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，这表明IL-37能够抑制食管癌细胞的炎症反应。

STAT3是STAT家族的一个重要成员，酪氨酸磷酸化激活后形成二聚体，易位到核内，识别STAT3特异性DNA结合位点，转录激活靶基因。STAT3在人类多种肿瘤中处于活化状态，活化的STAT3与肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭,血管生成和转移有关。本研究发现，IL-37能够降低食管癌细胞pSTAT3 Y705的表达。这表明IL-37可能是通过IL-6/STAT3信号通路发挥作用的。我们通过瞬时转染pcDNA3.1-IL-6使IL-6过表达，然后加入重组IL-37蛋白，验证IL-37是否是通过该信号通路起作用的。结果发现，过表达IL-6导致pSTAT3 Y705、Bcl-2表达增加，Caspase-3表达降低。Bcl-2是一个重要的抗凋亡因子，在肿瘤细胞的抗凋亡机制中具有关键作用；活化的Caspase-3能够促进细胞凋亡。过表达IL-6后，Bcl-2表达增加及Caspase-3表达减少也进一步验证了IL-6的抗凋亡作用。加入重组IL-37蛋白后降低了IL-6过表达诱导的pSTAT3 Y705、Bcl-2的表达，增加了Caspase-3的活化，这表明IL-37在食管癌细胞中是通过IL-6/STAT3发挥作用的。另外，IL-37还可以下调IL-6诱导的TNF-α和IL-1β的表达，这表明IL-37对炎症的抑制作用也与IL-6/STAT3信号通路有关。

总之，IL-37能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移和炎症反应，而且还可以诱导其凋亡，这些作用可能是通过抑制IL-6/STAT3信号通路发挥作用的。这为临床上食管癌的治疗提供了一定的理论基础和新的治疗方向。但是本研究仅在体外探究了IL-37对食管癌细胞的作用，它在体内对食管癌的作用仍需进一步探究。

[1] Yue D, Zhang Z, Li J, et al. Transforming growth factor-beta1 promotes the migration and invasion of sphere-forming stem-like cell subpopulations in esophageal cancer[J]. Exp Cell Res, 2015,336(1):141-149.

[2] McNamee EN, Masterson JC, Jedlicka P, et al. Interleukin 37 expression protects mice from colitis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(40):16711-16716.

[3] Teng X, Hu Z, Wei X, et al. IL-37 ameliorates the inflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokine production[J]. J Immunol, 2014,192(4):1815-1823.

[4] Jiang Y, Wang Y, Liang L, et al. IL-37 mediates the antitumor activity in renal cell carcinoma[J]. Med Oncol, 2015,32(11):250.

[5] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA, et al. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity[J]. Nat Immunol, 2010,11(11):1014-1022.

[6] Gao W, Kumar S, Lotze MT, et al. Innate immunity mediated by the cytokine IL-1 homologue 4 (IL-1H4/IL-1F7) induces IL-12-dependent adaptive and profound antitumor immunity[J]. J Immunol, 2003,170(1):107-113.

[7] Wang S, An W, Yao Y, et al. Interleukin 37 expression inhibits STAT3 to suppress the proliferation and invasion of human cervical cancer cells[J]. J Cancer, 2015,6(10):962-969.

[8] Colotta F, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability[J]. Carcinogenesis, 2009,30(7):1073-1081.

[9] Balkwill F. Tumour necrosis factor and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(5):361-371.

[10] Chen MF, Lu MS, Chen PT, et al. Role of interleukin 1 beta in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Mol Med (Berl), 2012,90(1):89-100.

[11] Leu CM, Wong FH, Chang C, et al. Interleukin-6 acts as an antiapoptotic factor in human esophageal carcinoma cells through the activation of both STAT3 and mitogen-activated protein kinase pathways[J]. Oncogene, 2003,22(49):7809-7818.

重庆市万州区科委项目(201203051)。

张军(E-mail:cbaoqing@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.010

R735.1

A

1002-266X(2016)45-0034-04

2016-05-28)