青岛地区儿童淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1基因变异及意义

岳康，高翔翔，李斐斐，王云

(1 青岛大学医学院，山东青岛266021；2青岛大学附属医院；3 青岛市城阳区流亭卫生院)



青岛地区儿童淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1基因变异及意义

岳康1,2，高翔翔3，李斐斐1，王云1

(1 青岛大学医学院，山东青岛266021；2青岛大学附属医院；3 青岛市城阳区流亭卫生院)

目的 了解青岛地区儿童淋巴瘤中EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)基因多态性。并探讨LMP1变异在儿童淋巴瘤发生中的意义。方法 采用巢式PCR和DNA测序检测66例青岛地区EBV阳性儿童淋巴瘤组织中LMP1全长序列，根据其特征性突变和系统进化树，对基因变异进行分类，并与以往同一地区成人NK/T细胞淋巴瘤和健康人群中LMP1变异类型的分布进行比较。结果 66例标本完成测序，共发现3种LMP1亚型，即China 1、China 2和Med-，其构成比分别为84.8%、7.6%和6.1%，另有1例(1.5%)为China 1/China 2重组病毒株。LMP1 N端XhoⅠ位点缺失变异即XhoⅠ(-)和未缺失型XhoⅠ(+)的检出率分别为93.9%和6.1%；C端30 bp缺失即del-LMP1和未缺失型wt-LMP1的检出率分别为84.8%和15.2%。儿童淋巴瘤和成人NK/T细胞淋巴瘤中LMP1各亚型的分布差异无统计学意义，但儿童淋巴瘤中China 1亚型、XhoⅠ(-)和del-LMP1的检出率高于健康人群(P均<0.05)。结论 青岛地区儿童淋巴瘤中LMP1以China 1亚型、XhoⅠ(-)和del-LMP1为主，LMP1变异可能与儿童淋巴瘤的发生相关。

淋巴瘤；EB病毒；潜伏膜蛋白1；基因多态性；儿童；青岛

EB病毒(EBV)是重要的肿瘤病毒，与多种人类淋巴细胞和上皮细胞性肿瘤的发生有关。与EBV相关的淋巴细胞性肿瘤包括Burkitt′s淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、NK/T细胞淋巴瘤、免疫缺陷患者的淋巴细胞瘤和T细胞淋巴瘤等[1]。EBV致癌机制尚不明了，由于不同地域不同疾病来源的EBV毒株存在基因变异，EBV基因变异与肿瘤发生的关系一直是EBV致癌机制研究中的热点，多种EBV变异型已经被发现，但EBV基因变异与肿瘤发生的关系尚未明确。EBV潜伏膜蛋白1(LMP1)基因是重要的病毒癌基因，可以转化淋巴细胞、角质细胞和成纤维细胞，抑制细胞凋亡，促进肿瘤转移。LMP1蛋白含386个氨基酸，分为N端胞质区、跨膜区和C端胞质区，基因测序发现LMP1存在碱基突变、缺失和重复序列拷贝数改变等多种变异。报道较多的为XhoⅠ(-)变异型和del-LMP1变异型。有研究根据不同地域来源的LMP1蛋白发生的氨基酸突变，将LMP1分为7个亚型，分别为B95-8、China 1、China 2、China 3、Med(包括30 bp缺失的Med+和不缺失的Med-)、NC和Alaskan。以往有关LMP1基因变异与EBV相关淋巴瘤的研究多针对成人淋巴瘤，有研究支持某一LMP1变异型与淋巴瘤形成和发展有关[2～7];也有研究认为LMP1变异只与地域相关，与疾病的发生不相关[8,9]。2008年1月～2015年12月，本研究检测了青岛地区儿童淋巴瘤中LMP1基因全序列，采用不同的分类方法对LMP1变异进行分类，与同一地区EBV相关成人NK/T细胞淋巴瘤和健康人群数据[7]进行比较，探讨LMP1基因变异在儿童淋巴瘤发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 儿童淋巴瘤石蜡包埋组织标本66例份，均取自青岛市儿童医院、青岛大学附属医院和青岛市市立医院病理科，患者均居住在青岛地区，籍贯青岛。均通过肿块活检确诊。男39例、女27例，年龄1～17岁。HL 26例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)40例，其中NHL包括T淋巴细胞母细胞淋巴瘤16例、B淋巴细胞母细胞淋巴瘤8例、Burkitt′s淋巴瘤 6例、弥漫性大B细胞淋巴瘤3例、间变大细胞性淋巴瘤4例、滤泡性淋巴瘤1例和NK/T细胞淋巴瘤2例。

1.2 LMP1序列的检测 采用PCR产物直接测序法。每例淋巴瘤石蜡包埋组织标本取10 μm切片8张，采用FFPE石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取DNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。设计合成扩增LMP1全长序列的引物，采用巢式PCR扩增LMP1序列，引物序列及PCR扩增条件见参考文献[7]。采用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增条带，以内巢PCR引物作为测序引物，采用末端终止法对内巢PCR扩增产物进行双向测序，测序反应由北京华大基因有限公司完成。测序成功后，用Chromas软件查看峰图文件；以EBV标准株B95-8为参照序列，通过DNAStar软件(Lasergene，version 7.0)对序列进行比对分析。

1.3 LMP1全长序列分析 LMP1编码基因包括3个外显子和2个内含子，对1.2中获得的DNA序列，采用DNAStar软件剪切和拼接，翻译成蛋白序列。采用MEGA 5.0软件用Clastal W方法将本研究所获得LMP1蛋白序列以及GenBank中发表LMP1亚型(B95-8、China 1、China 2、China 3、Med-、NC和Alaskan)代表序列进行同源性分析，绘制系统进化树，根据其特征性突变及系统进化树确定LMP1变异类型，并分析其XhoⅠ(-)和del-LMP1变异情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料以率或百分比表示。儿童淋巴瘤和以往成人NK/T细胞淋巴瘤及健康人群LMP1基因变异类型的分布差异采用χ2检验或精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LMP1变异类型 和标准株B95-8比对，66例测序成功的样本均出现核苷酸和氨基酸序列改变。N端胞质区(aa1-24)和跨膜疏水结构区(aa25-186)只发生碱基突变，N端第17位氨基酸出现核苷酸t→g突变导致XhoⅠ酶切位点丢失，即为XhoⅠ(-)变异；C端胞质区(aa187-386)除碱基突变外，还出现2处缺失(aa343-352 GGGHSHDSGH缺失即30 bp缺失和aa276-280 HDPLP缺失，后者位于下述第2和3重复序列之间)以及重复序列(aa 254 后11个aa QDPDNTDDNGP)拷贝数变化。通过序列比对及系统进化树分析，在66例份淋巴瘤样本中共发现3种LMP1亚型，即China 1、China 2和Med-。China 1亚型56例(84.8%，56/66)，其40处共有突变与China 1代表序列一致；China 2亚型5例(7.6%，5/66)，出现48处共有突变，除缺乏错义突变E128D和同义突变a168361g(aa230)外，其余突变与China 2代表序列相同；Med-亚型4例(6.1%，4/66)，出现14处共有突变，除增加了G212S突变外，其余突变与Med代表序列相同。每一亚型的标本序列中，少数标本在1～3个共有突变位点不发生突变或出现不同突变。所有China 1序列为XhoⅠ(-)/del-LMP1，China 2为XhoⅠ(-)/wt-LMP1，Med-为XhoⅠ(+)/wt-LMP1。另外还有1例标本(NHL16)在重复序列之前为China 1亚型特征，重复序列后为China 2亚型特征，为China 1/China 2重组株，分类为“Recombinant grouped”(RG)组，呈XhoⅠ(-)/wt-LMP1变异。除共有突变外，多数样本还伴有1～3处其他位点的散在突变。在重复序列区，样本均缺失第2和3重复序列之间的5个氨基酸。B95-8重复序列拷贝数为4，China 1亚型重复序列拷贝数为2～7拷贝，最多见的为5拷贝，其次为6和4拷贝；China 2亚型为2、3或4拷贝；Med-亚型为3、4或5拷贝；重组病毒株NHL16为3拷贝。在重复序列的11个氨基酸中，China 1亚型毒株很少出现突变，而4例Med-亚型标本均出现突变1处或2处，5例China 2样本中出现1处突变4例。

2.2 LMP1变异类型在儿童淋巴瘤中的分布 儿童淋巴瘤中不同LMP1变异型的分布见表1。3种变异分类的LMP1变异型分别以China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1为主。与以往我们检测的同一地区数据[7]比较，3种变异分类的LMP1变异型在儿童淋巴瘤和成人NK/T细胞淋巴瘤中的分布差异无统计学意义，而儿童淋巴瘤与健康人群中的分布差异有统计学意义(亚型：P=0.015；XhoⅠ位点：P=0.002；30 bp缺失：P=0.016)，儿童淋巴瘤中China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1的检出率均高于健康人群(P均<0.05)。成人NK/T细胞淋巴瘤中China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1的检出率亦均高于健康人群(亚型：P=0.022；XhoⅠ位点：P=0.003；30 bp缺失：P=0.029)[7]。

表1 LMP1各变异型在儿童淋巴瘤、成人NK/T细胞淋巴瘤及健康人群中的分布[例(%)]

3 讨论

本研究对青岛地区66例儿童淋巴瘤中LMP1基因全序列进行了检测及分析，采用不同的分类方法对LMP1变异进行分类，并比较不同变异分类之间的对应关系，全面真实地反映了儿童淋巴瘤中LMP1基因变异情况。以往针对LMP1基因多态性的研究，多数只检测XhoⅠ(-)和(或)del-LMP1变异，测序研究也只检测C末端一段较短的序列，而结合我们的结果和LMP1各亚型的代表序列，可以发现XhoⅠ(-)变异可见于China 1、China 2、Alaskan和NC亚型，XhoⅠ(+)见于B95-8、Med+和Med-亚型；del-LMP1见于China 1和Med+亚型，其余亚型均为wt-LMP1。另外，本研究还检测到重组病毒株1例，以往在口腔扁平苔癣、成人NK/T细胞淋巴瘤、NPC和健康人群中也检测到重组病毒株[2,7,10,11]。重组病毒株的LMP1序列具有不同亚型的特征性改变，使LMP1亚型与XhoⅠ位点和30 bp缺失变异的关系更复杂。而且在C末端11个氨基酸重复序列区域，不同标本重复次数从2～7不等，不同亚型也呈现不同变异。以往有研究还发现了LMP1新亚型SEA1和SEA2[6]以及69 bp(aa333-355)缺失序列[12]。由此可见，LMP1变异复杂多变，在分析LMP1变异时，不能只检测XhoⅠ(-)变异和(或)del-LMP1变异，最好针对LMP1基因全序列进行检测分析，才能准确反映LMP1变异情况。

本研究青岛地区儿童淋巴瘤以China 1、XhoⅠ(-)和del-LMP1变异为主，这与该地区EBV相关NPC、胃癌、成人NK/T细胞淋巴瘤及健康人群[7,10]类似，也与亚洲其他地域如北京、日本和中国南方等地域NPC和成人淋巴瘤[2,3,8,9,13,14]一致。目前只有少数研究对儿童淋巴瘤中LMP1基因多态性进行了研究，Santón等[15]报道del-LM1在24例西班牙儿童淋巴瘤和22例健康儿童中的检出数分别为19(79.2%)和8例(36.4%)，其中分别有12例淋巴瘤和6例健康儿童为del-LMP1和wt-LMP1混合感染。Lorenzetti等[16]检测来自阿根廷的20例EBV阳性儿童淋巴瘤和15例传染性单核细胞增多症(IM)，淋巴瘤中del-LMP1的检出率为65.0%(13/20)，China 1、Med-、Alaskan和B95-8亚型的检出数分别为13、2、4、1例；而IM中del-LMP1的检出率为53.3%(8/15)，China 1、Med-、China 2、Med-&China 2混合感染以及Med-&China 3混合感染的检出数分别为7、4、2、1、1例。谢正德等[17]的结果显示，del-LMPl在北京地区25例儿童HL、8例NHL和15例淋巴结反应性增生疾病中的检出数分别为11(44.0%)、3(37.5%)和5例(33.3%)。本研究China 1和del-LMP1在儿童淋巴瘤中的检出率高于西班牙和阿根廷病例，可能与地域分布有关，因为以往研究表明China 1和del-LMP1是亚洲人群的主要亚型[2,7,10,13,14]，而与北京地区儿童淋巴瘤检出率的不同可能与地区差异及北京地区病例数较少有关。

本研究与以往同一地区不同人群数据比较表明，儿童淋巴瘤和成人NK/T细胞淋巴瘤LMP1变异类型分布比例相差不大，但健康人群中China 1、del-LMP1和XhoⅠ(-)的检出率低于儿童淋巴瘤，提示China 1亚型病毒株可能与儿童淋巴瘤的发生相关。Santón等[15]的研究表明，del-LMP1在儿童淋巴瘤的检出率(79.2%)高于健康儿童(36.4%)，提示del-LMP1与儿童淋巴瘤有关。Lorenzetti等[16]认为儿童淋巴瘤和IM中LMP1变异类似，但与该地区健康人群(成年人群)不同，从而认为LMP1变异既与淋巴瘤相关，也与IM相关。谢正德等[17]认为，del-LMP1在EBV阳性的儿童HL、NHL和淋巴结反应性增生病例中的分布相同，与疾病本身没有关系。关于LMP1变异与疾病的相关性，目前流行病学研究和功能学研究均未获得一致结论[13]。但有不少流行病学研究发现，肿瘤组织中XhoⅠ(-)变异和(或)del-LMP1变异高于对照人群，认为LMP1变异与肿瘤相关[3～7,15]。也有功能学研究表明，China 1亚型LMP1致癌能力和免疫逃逸能力增强，容易出现在NPC和HL等肿瘤中[5,18]。目前有关儿童淋巴瘤中LMP1变异的研究较少，样本例数偏少且缺乏合适的对照人群，LMP1基因变异与儿童淋巴瘤发生的确切关系有待进一步阐明。

[1] Grywalska E, Rolinski J. Epstein-Barr virus-associated lymphomas [J]. Semin Oncol, 2015,42(2):291-303.

[2] Kang MS, Kieff E. Epstein-Barr virus latent genes [J]. Exp Mol Med，2015，47(1):e131.

[3] Edwards RH, Seillier-Moiseiwitsch F, Raab-Traub. Signature amino acid changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein-Barr virus strains [J]. Virology, 1999,261(1):79-95.

[4] Edwards RH, Sitki-Green D, Moore DT, et al. Potential selection of LMP1 variants in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Virol, 2004,78(2):868-881.

[5] Kingma DW, Weiss WB, Jaffe ES, et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 oncogene deletions: correlations with malignancy in Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorders and malignant lymphomas[J]. Blood, 1996,88(1):242-251.

[6] Guiretti DM, Chabay PA, Valva P, et al. Structural variability of the carboxy-terminus of Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 gene in Hodgkin′s lymphomas[J]. J Med Virol, 2007,79(11):1722-1730.

[7] Saechan V, Mori A, Mitarnun W, et al. Analysis of LMP1 variants of EBV in Southern Thailand: evidence for strain-associated T-cell tropism and pathogenicity[J]. J ClinVirol, 2006,36(2):119-125.

[8] 刘芡芡，孙玲玲，王宏，等.EB病毒潜伏膜蛋白1基因多态性与NK/T细胞淋巴瘤的相关性[J].癌变·畸变·突变，2015，27(4)：266-271.

[9] Zhou XG, Sandvej K, Li PJ, et al. Epstein-Barr virus gene polymorphisms in Chinese Hodgkin′s disease cases and healthy donors: identification of three distinct virus variants[J]. J Gen Virol, 2001,82(5):1157-1167.

[10] Khanim F, Yao QY, Niedobitek G, et al. Analysis of Epstein-Barr virus gene polymorphisms in normal donors and in virus-associated tumors from different geographic locations [J]. Blood, 1996,88 (9):3491-3501.

[11] Palser AL, Grayson NE, White RE, et al. Genome diversity of epstein-barr virus from multiple tumor types and normal infection [J]. J Virol, 2015,89(10):5222-5237.

[12] Tacyildiz N, Cavdar AO, Ertem U, et al. Unusually high frequency of a 69-bp deletion within the carboxy terminus of the LMP-1 oncogene of Epstein-Barr virus detected in Burkitt′s lymphoma of Turkish children[J]. Leukemia, 1998,12(11):1796-1805.

[13] Chang CM, Yu KJ, Mbulaiteye SM, et al. The extent of genetic diversity of Epstein-Barr virus and its geographic and disease patterns: a need for reappraisal[J]. Virus Res, 2009,43(2):209-221.

[14] Huang YH, Wu QL, ZongYS, et al. Nasopharyngeal extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type: retrospective study of 18 consecutive cases in Guangzhou, China [J]. Int J Surg Pathol, 2011,19(1):51-61.

[15] Santón A, Martín C, Manzanal AI, et al. Pediatric Hodgkin′s disease in Spain: association with Epstein-Barr virus strains carrying latent membrane protein-1 oncogene deletions and high frequency of dual infections[J]. Br J Haematol, 1998,103(1):129-136.

[16] Lorenzetti MA, Gantuz M, Altcheh J, et al. Distinctive Epstein-Barr virus variants associated with benign and malignant pediatric pathologies: LMP1 sequence characterization and linkage with other viral gene polymorphisms[J]. J Clin Microbiol, 2012,50(3):609-618.

[17] 谢正德，周舂菊，王琳，等.儿童淋巴瘤患者EBV-LMPl基因C末端30 bp缺失突变检测[J].中华实验和临床病毒学杂志，2008,22(6):464-467.

[18] Lo AK, Huang DP, Lo KW, et al. Phenotypic alterations induced by the Hong Kong-prevalent Epstein-Barr virus-encoded LMP1 variant (2117-LMP1) in nasopharyngeal epithelial cells [J]. Int J Cancer, 2004,109(6):919.

Gen mutations of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in pediatric lymphomas of Gingdao area

YUEKang1,GAOXiangxiang,LIFeifei,WANGYun

(1MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Objective To understand the gene polymorphisms of Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) gene in pediatric patients with lymphoma from Qingdao area and to investigate the significance of LMP1 in the development of pediatric lymphomas. Methods Nested-PCR and DNA sequencing were used to analyze the gene sequences of LMP1 in isolates from 66 cases of EBV-positive samples of children with lymphomas. The sequences of LMP1 were classified according to the signature changes and the phylogenetic tree. The distribution of LMP1 variants in pediatric lymphoma cases was compared with the previous data from adult NK/T cell lymphoma cases and healthy donors in the same area. Results Three subtypes of LMP1 gene, China 1, China 2 and Med-, were observed in 66 isolates, with distribution of 84.8%, 7.6% and 6.1%, respectively. Another 1 (1.5%) isolate was recombinant strain of China 1 and China 2. The frequencies of XhoI(-) variant (loss XhoI site in N-terminus of LMP1) and prototype XhoI(+) were 93.9% and 6.1%, respectively, and those of del-LMP1 variant (30 bp deletion in C-terminus of LMP1) and prototype wt-LMP1 were 84.8% and 15.2%, respectively. The distribution of LMP1 variants in pediatric lymphoma was similar to that in adult NK/T cell lymphoma, while the frequency of China 1, XhoI(-) or del-LMP1 in children with lymphoma was significantly higher than that in healthy donors (allP<0.05). Conclusion China 1, XhoI(-) and del-LMP1 are the major LMP1 subtypes in pediatric lymphomas from Qingdao and may associate with the susceptibility of pediatric lymphomas.

lymphoma; Epstein-Barr virus; latent membrane protein 1; gene polymorphism; child; Qingdao

国家自然科学基金资助项目(81171571);青岛市科技计划项目(13-1-3-50-nsh)。

岳康(1985-)，男，硕士研究生,主要研究方向EB病毒基因多态性。E-mial：yuekang373657@126.com

王云(1970-))，女，教授,主要研究方向为EB病毒致癌机制。E-mial：qdwangyun@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.006

R373

A

1002-266X(2016)45-0019-04

2016-08-09)