局部植入神经干细胞/胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用观察

孙庆治，周成福，李莹

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

局部植入神经干细胞/胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用观察

孙庆治，周成福，李莹

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

目的 观察局部植入神经干细胞/胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法 分离、培养、鉴定SD大鼠神经干细胞，将其植入胶原支架中，制备神经干细胞/胶原支架复合体。取90只6周龄SD大鼠，随机分为A、B、C组，各30只，均常规行左侧脊髓半切术，制备T10脊髓半横断损伤模型;A组脊髓切除后于缺损区植入神经干细胞/胶原支架复合体，B组脊髓切除后于缺损区植入胶原支架，C组脊髓切除后不作特殊处理。术后1～8周，每周分别对三组大鼠进行BBB评分(评价其左后肢运动功能)；术后第4、8周时，三组各处死大鼠15只，进行脊髓组织结构及病理形态观察。结果 ①术后第4～8周时，A组大鼠的左下肢BBB评分明显高于B、C组(P均<0.05)。②术后第4周时，A组大鼠脊髓内支架与周围组织连接紧密，有少量空洞形成；B组大鼠脊髓内支架与周围神经组织形成纤维蛋白连接，并有较多空洞形成；C组大鼠脊髓缺损较大，缺损区周边有较多神经元及神经胶质细胞死亡。术后第8周时，A组大鼠脊髓内有较多的神经纤维生成，支架与周围神经组织形成一体，连接紧密，无空洞形成；B组大鼠脊髓内衣支架与周围神经组织连接较紧密，有一定量的空洞形成；C组大鼠脊髓缺损区有岛状神经组织形成，细胞排列不整，仍有大面积缺损区存在。③术后第4周时，A组大鼠脊髓缺损区的神经纤维排列较规律，B组与C组脊髓缺损区排列杂乱。术后第8周时，A组脊髓缺损区神经纤维排列有序，彼此间连接紧密；B组与C组脊髓缺损区神经纤维，但仍杂乱，纤维之间不能形成突触连接。结论 局部植入神经干细胞/胶原支架复合体可以较好修复损伤的大鼠脊髓，并促进大鼠肢体运动功能的恢复。

脊髓损伤；神经干细胞；胶原支架；神经干细胞/胶原支架复合体；BBB评分

脊髓损伤患者会出现损伤平面以下的肢体感觉、运动丧失及大小便障碍[1]。目前，脊髓损伤的治疗主要是通过手术对脊髓进行减压及内固定，但疗效并不理想。近年来，有关干细胞移植治疗脊髓损伤的研究较多，但效果不一。胶原蛋白可以引导神经再生，具有免疫原性低、组织相容性好的特点[2,3]。2015年10月8日～2016年3月1日，我们将SD大鼠的神经干细胞植入胶原支架中，制备神经干细胞/胶原支架复合体，将其用于大鼠脊髓损伤的修复，并进行了观察。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料、主要试剂及仪器 SPF级6周龄SD大鼠共120只，体质优良，平均体质量270 g，雌雄不限。胶原支架由佳木斯大学材料工程学院王晶教授课题组惠赠(新鲜牛筋膜剔除脂肪及肌肉成分后通过化学方法去除可溶性蛋白，干燥后就是有序的可用胶原蛋白，将其制备成2 mm3块状，即胶原支架)。DMEM/F12培养基，表皮生长因子(EGF)，无血清培养添加剂B27，碱性成纤维生长因子(bFGF)，多聚赖氨酸，巢蛋白(Nestin)溶液，核因子抗体。TC2323二氧化碳培养箱。

1.2 神经干细胞/胶原支架复合体的制备 取6周龄SPF级SD大鼠30只，雌雄配对后隔离饲养，待乳鼠出生后24 h内分离其海马组织，切成1 mm×1 mm×1 mm组织块，吸管反复吹打，使其呈悬液状，200目滤网过滤悬液，制成均匀一致的细胞悬液，台盼蓝染色细胞悬液并观察细胞存活情况。调整细胞密度为5×105/mL，接种于培养瓶中，加入20 ng/mL 的bFGF、20 ng/mL 的EGF和含2% B27的DMEM/F12培养液。将培养瓶放入 培养箱(37 ℃、5% CO2、80%湿度)培养，3 d换液(半量换液)1次。细胞原代培养7 d后，高速离心细胞悬液得到神经干细胞球，用吸管轻轻吹打细胞球后将其移入高速离心管内离心，去除上清液后用小尖头吸管继续吹打，将神经干细胞球制成单细胞悬液，台盼蓝染色，计算细胞存活率，细胞分瓶继续传代，7～10 d传代1次。取第4代神经干细胞球，制成单细胞悬液，种植在培养基上附片、固定，加入条件培养基24 h后，进行免疫组化染色鉴定,细胞表达Nestin作为神经干细胞的标志。将提前备好的胶原支架进行消毒，在无菌环境下将神经干细胞种植于胶原支架上。

1.3 SD大鼠脊髓损伤模型制作及神经干细胞/胶原支架复合体植入 90只SD大鼠随机分为A、B、C组，各30只。三组均常规行左侧脊髓半切术，切除脊髓2 mm×3 mm×4 mm。A组脊髓切除后于缺损区植入神经干细胞/胶原支架复合体，B组脊髓切除后于缺损区植入胶原支架，C组脊髓切除后不作特殊处理；三组常规缝合手术切口。术后辅助大鼠大小便，同时防止大鼠自食。

1.4 神经干细胞/胶原支架复合体对SD大鼠脊髓损伤修复作用的观察 术后每周1次(每次观察5 min)对三组大鼠进行BBB评分[8](评价其左后肢运动功能)，共8次。术后4周、8周时每组各处死大鼠15只，切取其T6～T12节段脊髓，固定24 h，制成薄切片，HE染色，镜下观察脊髓组织结构。采用免疫组化SP法对大鼠脊髓切片进行染色，观察脊髓病理改变。

2 结果

2.1 术后三组大鼠左下肢BBB评分比较 术后第1～8周三组大鼠左下肢BBB评分比较见表1。

2.2 术后三组大鼠脊髓组织结构及病理改变 ①术后第4、8周时三组大鼠脊髓组织结构(见图1)：术后第4周时，A组大鼠脊髓内支架与周围组织连接紧密，有少量空洞形成；B组大鼠脊髓内支架与周围神经组织形成纤维蛋白连接，并有较多空洞形成；C组大鼠脊髓缺损较大，缺损区周边有较多神经元及神经胶质细胞死亡。术后第8周时，A组大鼠脊髓内有较多的神经纤维生成，支架与周围神经组织形成一体，连接紧密，无空洞形成；B组大鼠脊髓内衣支架与周围神经组织连接较紧密，有一定量的空洞形成；C组大鼠脊髓缺损区有岛状神经组织形成，细胞排列不整齐，仍有大面积缺损区存在。②术后第4、8周时三组大鼠脊髓病理改变(见图2)：术后第4周时，A组大鼠脊髓缺损区的神经纤维排列较规律，B组与C组脊髓缺损区神经纤维排列杂乱。术后第8周时，A组脊髓缺损区神经纤维排列有序，彼此间连接紧密；B组与C组脊髓缺损区神经纤维仍杂乱，纤维之间不能形成突触连接。

表1 术后第1～8周三组大鼠左下肢BBB评分比较(分，

注：与C组相比，*P<0.05；与B组相比，P<0.05。

3 讨论

近年来，多数医学研究人员提出通过材料学、分子生物学途径来修复损伤的脊髓，但相关研究都没有取得突破。本实验利用神经干细胞与组织工程材料有机结合形成的复合植入材料，诱导神经干细胞修复受损的脊髓神经，期望能为脊髓损伤的临床治疗提供新的研究方向。

注：a、b、c分别为术后第4周时A、B、C组大鼠脊髓组织结构，d、e、f分别为术后第8周时A、B、C组大鼠脊髓组织结构。

图1 术后第4、8周时三组大鼠脊髓组织结构(HE染色，200×)

注：a、b、c分别为术后第4周时A、B、C组大鼠脊髓病理形态；d、e、f别为术后第8周时A、B、C组大鼠脊髓病理形态。

图2 术后第4、8周时三组大鼠脊髓病理形态(免疫组化染色，200×)

脊髓损伤的动物实验研究大多以SD大鼠作为实验对象[4]。造成脊髓损伤的实验方法较多，如Allen重物打击法及改良方法、脊髓压迫法、脊髓牵拉法、脊髓切割法等。无论选择哪种方法，其目的就是要创造一个理想化、更接近临床的脊髓损伤模型。理想的模型要具有操控性、重复性、稳定性等特点[5～7]。脊髓切割法更符合这一要求，所以在本研究中选择此种方法制备脊髓损伤模型。在脊髓损伤模型制备中，以T10为中心，造成脊髓损伤，原因是大鼠胸段脊髓损伤椎板咬除便利，且可以避开排便神经，更便于术后护理[8]。要保证术后大鼠存活率，要求用同一方法制备脊髓损伤模型[9,10]，并做到以下几点：①术后的大鼠分开饲养，避免拥挤及踩踏事件的发生；②手术操作过程中要细心、轻柔，造成的创伤不能太大，避免损伤硬脊膜；③因随着脊髓损伤节段的增高，实验动物的死亡率增高，故损伤的脊髓节段不要太高，一般选择T9或T10节段[11,12]，本研究选择的是T10节段；④造成脊髓损伤后，用抗生素反复冲洗伤口，持续肌注抗生素至术后第3天，通过观察大鼠尿路感染情况及大鼠的状态来决定是否停用抗生素；⑤术后给予大鼠皮下注射生理盐水2 mL，保证大鼠水分充足；⑥术后每天给大鼠挤尿，5 min/次，2次/d，1周后恢复大鼠的自主排尿；⑦保持大鼠笼舍干爽，每2天换1次窝内垫料；⑧每天用白炽灯照射鼠舍2 h,保证大鼠舍内温度适宜[13,14]。

在本研究中，BBB评分结果表明，在术后前4周三组大鼠左下肢运动功能恢复较快，第5～8周左下肢功能恢复较慢，其中A、B组比C组左后肢运动功能恢复快，A组大鼠左后肢运动功能恢复最好。组织学观察可见，术后第4周时A组大鼠脊髓内支架与周围组织连接紧密、有少量空洞形成，术后第8周时大鼠脊髓内有较多的神经纤维生成、支架与周围神经组织形成一体且连接紧密、无空洞形成；术后第4周时B组大鼠脊髓内支架与周围神经组织形成纤维蛋白连接、有较多空洞形成，术后第8周时大鼠脊髓内支架与周围神经组织连接较紧密、有一定量的空洞形成；术后第4周时C组脊髓缺损较大、缺损周边有较多神经元及胶质细胞死亡，术后第8周时脊髓缺损面积减少、缺损区有散在神经组织形成、细胞排列不整、仍有大面积缺损存在。无论术后第4周时还是第8周时，A组大鼠脊髓的恢复均优于B、C组，第8周时其支架与周围神经组织形成一体，更能促进神经的恢复。病理观察可见，A组脊髓损伤处有较多的新生神经纤维，能更好地与原有周围神经组织形成连接，而B组与C组脊髓损伤处仅有较少的神经纤维生长，更能说明A组的处置方法可以为神经纤维的生成提供良好的生物环境。

综上所述，局部植入神经干细胞/胶原支架复合体可以较好修复损伤的大鼠脊髓，并促进大鼠肢体运动功能的恢复。

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黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531717)。

李莹(E-mail： sqz_sun@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.013

R744

A

1002-266X(2016)43-0044-03

2016-04-01)