Mindbomb同源物2基因转染对人脑胶质瘤细胞U251增殖的影响及其机制

单小松，刘海鹏，郑克彬，方川，丁亚楠

(河北大学附属医院，河北保定071000)

Mindbomb同源物2基因转染对人脑胶质瘤细胞U251增殖的影响及其机制

单小松，刘海鹏，郑克彬，方川，丁亚楠

(河北大学附属医院，河北保定071000)

目的 观察Mindbomb同源物2(MIB2)基因转染对人脑胶质瘤细胞U251增殖的影响，并探讨其作用机制。方法 将U251细胞分为空白对照组、阴性对照组、实验组1、实验组2；空白对照组不作任何处理，阴性对照组转染空载体FLAG质粒，实验组1转染MIB2-FLAG质粒，实验组2转染siMIB2。用PCR法检测各组细胞的MIB2 mRNA，用蛋白质印迹法检测各组细胞的MIB2、核因子κB(NF-κB)抑制性蛋白(IκB)、NF-κB蛋白，用MTT法检测各组细胞的光密度值。结果 实验组1的MIB2 mRNA相对表达量为19.43±3.21、实验组2为0.43±0.17、阴性对照组为1.03±0.12；实验组1、实验组2与阴性对照组相比，P均<0.01。实验组1的MIB2、核因子κB(NF-κB)抑制性蛋白、NF-κB蛋白相对表达量分别为5.11±0.41、0.49±0.13、4.99±0.32，实验组2分别为0.43±0.17、3.12±0.36、0.49±0.14，阴性对照组分别为1.09±0.11、1.02±0.46、1.01±0.21；实验组1、实验组2与阴性对照组相比，P均<0.01；在36、48、72 h三个时点，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组1的U251细胞光密度值升高(P均<0.01)。结论 转染MIB2基因后人脑胶质瘤U251细胞的增殖能力增强，MIB2基因可能是通过MIB2蛋白调控NF-κB信号通路而发挥作用。

Mindbomb同源物2；核因子κB；核因子κB抑制性蛋白；脑胶质瘤；细胞增殖

人脑胶质瘤是颅内常见的侵袭性肿瘤之一。核因子κB(NF-κB)信号通路的异常活化在脑胶质瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用[1,2]。作为一种重要的核转录调控因子，NF-κB在不同类型的肿瘤发生过程中均有异常活化，它可以抑制有缺陷的细胞进入凋亡的过程、促进肿瘤细胞增殖、辅助肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞对放疗和化疗的耐受并导致肿瘤复发[3]。NF-κB表达被其抑制分子NF-κB抑制性蛋白(IκB)所调控，IκB可以与NF-κB的Rel同源结构域相互作用，通过覆盖NF-κB上的核定位序列阻碍其活化[4]。Mindbomb同源物2(MIB2)是泛素连接酶E3的配体，它可以通过泛素化途径降解IκB并最终实现对NF-κB的调控[5]。脑胶质瘤细胞内是否存在泛素化调节途径一直未见报道。2015年10月～2016年1月，我们通过建立脑胶质瘤细胞U251高表达和敲除MIB2基因的细胞模型，观察该基因对U251细胞增殖的调节作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验材料 U251细胞。MIB2-FLAG，MIB2抗体，NF-κB抗体，p-IKKα/β抗体，siMIB2序列(合成于北京奥科鼎盛生物科技有限公司)，α-Tubulin抗体，QuantiTect Probe RT-PCR Kit试剂盒，ECL化学发光试剂盒等。

1.2 方法

1.2.1 U251细胞分组及基因转染 将U251细胞分为空白对照组、阴性对照组、实验组1、实验组2。将各组细胞接种于6孔板，细胞融合度达50%后进行基因转染：空白对照组不作任何处理；阴性对照组加入5 μL的空载体FLAG质粒溶液与5 μL的LipofectamineTM3000，静置5 min后加入200 μL的无血清RPMI1640培养基；实验组1加入5 μL的MIB2-FLAG质粒溶液与5 μL的LipofectamineTM3000，静置5 min后加入200 μL的无血清RPMI1640培养基；实验组2加入5 μL的siMIB2溶液与5 μL的LipofectamineTM3000，静置5 min后加入200 μL的无血清RPMI1640培养基。各组细胞培养16 h后，阴性对照组、实验组1、实验组2弃去原培养基，更换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养48 h后收集细胞并进行后续实验。

1.2.2 各组U251细胞MIB2 mRNA检测 采用实时定量PCR技术。取“1.2.1”中收集的各组U251细胞，用TRIzol裂解后提取总RNA，合成cDNA，对MIB2 mRNA和内参GAPDH mRNA进行实时定量PCR扩增，反应体系20 μL。第一步：95 ℃ 3 min，循环1次；第二步：95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s，循环35次；第三步：62～95 ℃，每2 s升高0～2 ℃，循环1次。将空白对照组的MIB2 mRNA定义为1，阴性对照组、实验组1、实验组2的MIB2 mRNA相对表达量用各组MIB2 mRNA与空白对照组MIB2 mRNA的比值表示。

1.2.3 各组U251细胞MIB2、IκB、NF-κB蛋白检测 采用蛋白质印迹法。取“1.2.1”中收集的各组U251细胞，蛋白裂解液裂解后收集到1.5 mL的EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min离心1 min，弃上清；BCA法进行蛋白定量。向SDS-PAGE凝胶中加入样本，电泳分离后电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；加入α-Tubulin、MIB2、IκB和NF-κB抗体，4 ℃过夜孵育后加入二抗，37 ℃孵育30 min。采用凝胶成像分析系统检测分析各条带的光密度值。将空白对照组的MIB2蛋白光密度值定义为1，阴性对照组、实验组1、实验组2的MIB2蛋白相对表达量用各组MIB2蛋白光密度值与空白对照组MIB2蛋白光密度值的比值表示。

1.2.4 各组U251细胞增殖情况观察 采用MTT法。取“1.2.1”中收集的各组U251细胞，胰酶消化后计数，按5×104/孔的密度接种96孔板，每组设5个复孔。分别于培养12、24、36、48、72 h时，每孔加入含5 mg/mL的MTT无血清DMEM培养基120 μL，避光培养4 h，吸去培养基，每孔加入100 μL的DMSO，置水平摇床上混匀15 min，于酶标仪490 nm波长处检测光密度值(光密度值高表示细胞增殖能力强)。

2 结果

2.1 各组U251细胞的MIB2 mRNA表达比较 实验组1的MIB2 mRNA相对表达量为19.43±3.21、实验组2为0.43±0.17、阴性对照组为1.03±0.12；实验组1、实验组2与阴性对照组相比，P均<0.01。

2.2 各组U251细胞的MIB2、IκB、NF-κB蛋白表达比较 实验组1的MIB2、IκB、NF-κB蛋白相对表达量分别为5.11±0.41、0.49±0.13、4.99±0.32，实验组2分别为0.43±0.17、3.12±0.36、0.49±0.14，阴性对照组分别为1.09±0.11、1.02±0.46、1.01±0.21；实验组1、实验组2的各指标与阴性对照组相比，P均<0.01。

2.3 各组U251细胞的增殖情况比较 各时点各组U251细胞光密度值比较见表1。

表1 各时点各组U251细胞光密度值比较±s)

注：与空白对照组相比，*P<0.01；与阴性对照组相比,#P<0.01。

3 讨论

NF-κB介导的细胞信号传导通路在肿瘤细胞的异常增殖过程中发挥重要作用，当NF-κB信号通路被异常激活，可以加速肿瘤细胞的增殖、增强肿瘤细胞的侵袭能力、提高肿瘤细胞的耐药性[6]。NF-κB家族包括p65 (Rel-A)、Rel-B、Rel (c-Rel)、NF-κB1 (p105/p50)与 NF-κB2 (p100/p52)。通常情况下NF-κB处于非活化状态，其活化直接受到IκB的抑制。在静息状态下，IκB氨基端上的丝氨酸发生特异磷酸化的蛋白激酶IκK处于无活性状态[7]。IκK由两个催化亚单位IκKα和IκKβ，以及一个调节亚单位IκKγ构成。IκK活化主要依赖于上游激酶对IκKβ氨基端的激酶结构域的磷酸化作用，活化后的IκKβ可以进一步磷酸化IκKα，而IκKβ和IκKα通过对IκBα亚基磷酸化，磷酸化后的IκBα的氨基端第21和22位赖氨酸残基通过E3泛素连接酶复合物与多个泛素分子共价结合而降解[8]。IκB的降解途径主要受到泛素-蛋白酶体系统(UPS)的调节。UPS是由泛素、泛素启动酶(包括泛素激活酶El、泛素载体蛋白E2、泛素连接酶E3和26S蛋白酶体)组成[9]。MIB2是泛素连接酶E3的配体，它可以活化泛素连接酶E3，这一过程可以直接导致内源性的UPS激活。当UPS活化时，就会降解IκB，使得NF-κB的信号通路活化，而这一信号通路活化后最直接的表现就是肿瘤细胞增殖能力、侵袭能力、耐药性增强[10,11]。

本研究发现，当人脑胶质瘤细胞U251中MIB2高表达时，其IκB蛋白的表达降低，而受到IκB蛋白直接调控的NF-κB蛋白表达明显增加，细胞增殖能力也明显增强。这一结果说明MIB2通过UPS实现对NF-κB的调节作用，进而对U251细胞的增殖发挥调节作用。

本研究同时设计了MIB2基因被敲除的阴性对照实验，结果显示，在实验组2中，当U251细胞的MIB2基因被敲除后，其MIB2蛋白、NF-κB蛋白表达明显降低，IκB蛋白的表达增加，这从反面进一步说明MIB2通过UPS实现对NF-κB的调节作用。但实验组2的U251细胞增殖能力没有明显变化，其原因可能是实验组2中MIB2基因只敲除了50%(不能做到基因完全敲除)，MIB2、NF-κB的表达虽然降低，但对细胞增殖能力的调控作用没用明显变化；如果使用MIB2抑制剂，可能会完全沉默MIB2基因，这样就会看到细胞增殖能力降低，但目前市场上尚无成品MIB2抑制剂出售，这是本实验的一个缺憾。

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Effects of Mindbomb homologue 2 gene transfection on proliferation of human glioma U251 cells

SHANXiaosong,LIUHaipeng,ZHENGKebin,FANGChuan,DINGYanan

(AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,China)

Objective To observe the effects of Mindbomb homologue 2 (MIB2) gene transfection on the proliferation of human glioma U251 cells, and to explore its mechanism. Methods U251 cells were divided into four groups: the control group, negative control group, experimental group 1 and experimental group 2. U251 cells in the control group was untreated; U251 cells in the negative control group was transfected with vector FLAG plasmid; and U251 cells in the experimental group 1 was transfected with MIB2-FLAG plasmid; U251 cells in the experimental group 2 was transfected siMIB2. MIB2 mRNA was detected by PCR, the expression of MIB2, nuclear factor-κB (NF-κB) inhibitory protein (IκB) and NF-κB protein was detected by Western blotting in each group, and the optical density (OD) values were detected by MTT. Results The expression of MIB2 mRNA in the experimental group 1, experimental group 2 and negative control group was 19.43±3.21, 0.43±0.17, and 1.03±0.12, respectively; and significant difference was found in the MIB2 mRNA between the experimental groups 1, 2 and the negative control group (allP<0.01). The expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the experimental group 1 was 5.11±0.41, 0.49±0.13 and 4.99±0.32, respectively; the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the experimental group 2 was 0.43±0.17, 3.12±0.36 and 0.49±0.14, respectively; and the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein in the negative control group was 1.09±0.11, 1.02±0.46 and 1.01±0.21, respectively. Significant difference was found in the expression of MIB2, IκB and NF-κB protein between the experimental groups 1, 2 and the negative control group (allP<0.01). At 36, 48 and 72 h, compared with the negative control group and blank control group, OD value of U251 cells in the experimental group 1 increased significantly (allP< 0.01). Conclusion After MIB2 gene tranfection, the proliferation of human glioma U251 cells increases and MIB 2 gene may play an important role in the regulation of NF-κB signaling pathway through MIB2 protein.

Mindbomb homologue 2; nuclear factor-κB; nuclear factor-κB inhibitory protein; glioma; cell proliferation

河北省临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目(361007)。

单小松(1978-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向为神经系统肿瘤的诊断及治疗。E-mail： shanxs888@outlook.com

简介：丁亚楠(1979-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向为脑胶质瘤、脑血管病和癫痫的外科治疗。E-mail： 2739718156@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.002

R739.41

A

1002-266X(2016)43-0004-03

2016-07-15)