镉对背角无齿蚌外套膜细胞凋亡相关酶活性和细胞结构的影响

李涌泉，杨惠珍，任玉娟，吴 昊，井维鑫，王 兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

镉对背角无齿蚌外套膜细胞凋亡相关酶活性和细胞结构的影响

李涌泉，杨惠珍，任玉娟，吴 昊，井维鑫，王 兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

应用酶学和组织显微技术，研究了镉（Cd）对背角无齿蚌（Anodonta woodiana）外套膜组织中细胞凋亡相关酶Caspase-3，8，9活性、H2O2含量和组织细胞超微结构的影响。结果显示，与对照组相比，随着Cd质量浓度的增加，外套膜Caspase-3活性表现为先降低后显著升高的趋势（P＜0.05）；Caspase-8活性呈现逐渐升高，差异显著（P＜0.05）；Caspase-9活性在低质量浓度和高质量浓度组显著降低，但中高质量浓度组显著升高（P＜0.05）。随着Cd质量浓度的增加，外套膜中H2O2含量呈现逐渐增高的趋势，差异显著（P＜0.05）。当Cd质量浓度为16.86 mg/L时，外套膜组织细胞结构的变化明显；细胞核染色质不规则凝聚、固缩和边集，核膜破裂；线粒体肿胀、嵴数量减少、空泡化比较严重；微绒毛排列杂乱、大部分断裂并且空泡化严重。当Cd质量浓度为67.45 mg/L时，外套膜组织细胞损伤更加明显；染色质大部分凝聚、固缩和边集，核膜严重肿胀并破裂；粗面内质网板层状结构解体后形成许多大小不同的小泡。研究表明，外套膜在酶活性和组织细胞结构上对镉的反应较快且更具规律性，而且具有明显的剂量效应关系。

背角无齿蚌；外套膜；半胱氨酸蛋白酶；细胞结构；镉

双壳贝类分布广泛、活动范围局限、对多种污染物具有一定的耐受性，其非常适合反映水体环境和底泥中重金属的污染状况[13-15]，是理想的污染物指示生物。背角无齿蚌（Anodonta woodiana）广泛分布于我国淡水水域中，作为“淡水贝类观察体系”的指示生物[16]，直接受到水域和底泥中重金属的污染，可以有效地反映水域重金属污染的状况[17-18]。目前，已经开展了关于背角无齿蚌生态和代谢生理[19]、重金属蓄积和元素分布[20-21]、矿质元素和氨基酸含量[22]、机体抗氧化系统酶活性[23]等方面的研究工作。

本试验就镉对背角无齿蚌外套膜的细胞凋亡相关酶和组织超微结构的影响进行了研究，旨在阐明镉对背角无齿蚌的毒性影响程度，为进一步筛选适合淡水水域重金属污染和评价的指示生物提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

背角无齿蚌（简称“河蚌”）购自太原市五龙口水产品批发市场，置实验室水族箱（50 cm×30 cm× 30 cm）中养殖14 d后备用。期间每隔3 d换水一次，隔1d喂食一次。养殖用水曝气48h，水温为（20± 2）℃，pH值为7.5±0.3，溶氧量为（8±1）mg/L。

1.2 试验设计

根据Cd对河蚌96h的LC50（134.9mg/L）的1/2，1/4，1/8，1/16，设置了8.43，16.86，33.72，67.45 mg/L共4个染毒组，同时设置一个对照组，处理时间96 h。选择个体大小基本一致的个体（体质量为（48.0±4.0）g，壳长为（6.8±0.3）cm）置处理缸（50 cm×35 cm×20 cm）中，每缸10只。处理期间不喂食、不换水，定时检查蚌体存活情况。

1.3 试剂及仪器

3.1 VBAC形成的背景 疤痕子宫患者再次妊娠是选用阴道分娩还是选用剖宫产，一直是一个争议的话题。传统意见[12]认为“一次剖宫产，永远剖宫产”，而选择阴道分娩方式风险极大；传统医疗条件比较差，疤痕子宫患者再次妊娠分娩时容易出现子宫破裂现象，因此大部分产妇通常选择剖宫产方式进行分娩。然而随着产科医生操作水平的不断提高，当代产科技术的不断进步，手术、抗菌药物与麻醉技术不断更新，使子宫切口得到明显改善，疤痕子宫患者再次妊娠采用阴道分娩的子宫破裂率并未增加。

试剂：氯化镉（CdCl2·2.5H2O）、氯化钠（NaCl），均为分析纯；Caspase-3，8，9活性及蛋白质含量测定试剂盒，购于碧云天生物技术研究所。H2O2含量测定试剂盒，购于南京建成生物研究所。

仪器设备：多功能酶标仪（MD SpectraMax M5）、透射电子显微镜（JEM-1011）、冷冻离心机（Eppendorf5804R）、样品处理制备系统（MP Fastprep-24）。

1.4 样品制备及酶活性和超微结构的测定方法

Cd（0，8.43，16.86，33.72，67.45 mg/L）处理96 h后，活体解剖河蚌取外套膜，滤纸吸净表面水分，称量后置－80℃冰箱中备用。试验时取约25 mg组织，加入250 μL裂解液后匀浆，按照Caspase-3，8，9活性、H2O2含量试剂盒说明书实验步骤操作。蛋白含量测定采用Bradford方法，并按照蛋白质含量测定试剂盒说明书实验步骤操作。

Cd（0，16.86，67.45 mg/L）处理96 h后，取河蚌解剖取外套膜，滤纸吸净表面水分后取3～5块组织块（约1 mm3），置于2%戊二醛（体积分数）中固定2 h，二甲胂酸钠缓冲液冲洗2次，再用1%锇酸（体积分数）固定。乙醇和丙酮梯度脱水，Epon618环氧树脂包埋，超薄切片机切片（切片厚度为50～70 nm），醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并拍照。

1.5 数据处理

试验结果所得数据采用SPSS 15.0软件包的单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行处理分析；显著性检验通过LSD法进行比较；所得结果均为平均值±标准差（mean±SD）；*表示P＜0.05下显著差异。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫对背角无齿蚌外套膜Caspase-3，8，9活性及H2O2含量的影响

图1-a结果显示，与对照组相比，随着Cd质量浓度的升高，外套膜中Caspase-3活性呈现出低质量浓度Cd胁迫下显著降低（8.43 mg/L，P＜0.05），中高质量浓度Cd下活性逐渐升高（33.72 mg/L，P＜0.05），高质量浓度Cd下活性回落（67.45 mg/L）。当Cd质量浓度为33.72 mg/L时，Caspase-3活性达到最大值。

从图1-b可以看出，随着Cd质量浓度的升高，外套膜中Caspase-8活性显现出在中高质量浓度Cd下逐渐增高的趋势，与对照组相比增高显著（16.86，33.72，67.45 mg/L，P＜0.05）。当Cd质量浓度为67.45 mg/L时，Caspase-8活性达到最大值。

由图1-c可知，与对照组相比，随着Cd质量浓度的升高，外套膜中Caspase-9活性在低质量浓度和高质量浓度Cd下显著下降（8.43，67.45 mg/L，P＜0.05），中高质量浓度Cd下活性显著升高（16.86，33.72 mg/L，P＜0.05）。当Cd质量浓度为33.72 mg/L时，Caspase-9活性达到最大值。

图1-d结果显示，随着Cd质量浓度的升高，外套膜中H2O2含量呈逐渐增高的趋势，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。当Cd质量浓度67.45 mg/L时，H2O2含量达到最大值。

2.2 镉对背角无齿蚌外套膜组织细胞亚显微结构 的影响

从图2-A～C可以看出，对照组外套膜组织细胞结构清晰完整，细胞表面微绒毛丰富且排列规则；细胞核结构完整，近圆形或卵圆形，核膜清晰规则，染色质分布均匀；线粒体呈圆形或椭圆形，形态正常，嵴丰富且规则排列；高尔基体和内质网形态正常。

从图2-D～E可以看出，16.82 mg/L Cd处理96 h后，对外套膜组织细胞结构影响较大；细胞体积缩小，细胞内空泡化严重；细胞表面微绒毛排列不整齐，空泡化严重，大部分脱落并逐渐减少和消失；细胞核形状不规则，核膜肿胀内陷并有破裂现象，染色质致密浓缩并呈新月形或戒指状边集结于核膜上，部分染色质出芽形成指状结构；线粒体形态异常，部分线粒体嵴数量减少且排列不整齐，肿胀变形且空泡化比较严重；核周围出现大量溶酶体，并有增大现象，内含很多沉积物。

图2-F～G结果显示，67.45 mg/L Cd处理96 h后，外套膜组织细胞结构损伤严重，细胞形态畸形，细胞膜消失，细胞内空泡化非常严重；细胞核形态严重变形，核膜水肿严重、折叠内陷并破裂，染色质严重浓缩并靠近核膜、出芽裂解成核碎片，形成凋亡小体；线粒体嵴模糊并消失，肿胀且空泡化严重；板层状结构粗面内质网解体，形成许多大小不同的小泡，表面附着核糖体；大部分细胞器消失，细胞内容物外泄。

3 讨论

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是一组特异性切割天冬氨酸的蛋白酶，在细胞凋亡进程中发挥着至关重要的作用，是细胞凋亡通路的汇聚点和执行凋亡的最终途径。Caspase在细胞凋亡过程中扮演着2类角色，一类为起始者Caspase，在细胞凋亡早期被活化后发挥作用；另一类为执行者Caspase，在细胞凋亡后期被活化后起凋亡执行作用[24]。Caspase-8和Caspase-9属于起始者Caspase，而Caspase-3属于执行者Caspase。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的执行者Caspase，在细胞凋亡网络中居于中心位置[25]。通常情况下，Caspase-3以无活性酶原形式分布于细胞质和线粒体基质中，可以被Caspase-8和Caspase-9通过凋亡信号转导通路而激活。Caspase-3被活化后，随即触发下游细胞凋亡链式反应，使细胞凋亡不可避免发生[26]。

有研究表明，在Cd诱导发生的细胞凋亡过程中，Caspase-3是关键的细胞凋亡效应分子[27]。典型环境污染物与生物胁迫课题组前期研究显示，Cd可以显著诱导河南华溪蟹鳃和肝胰腺组织中Caspase-3活性[11，28]。本研究结果显示，外套膜中Caspase-3活性在低质量浓度Cd（8.43 mg/L）处理后显著降低；中质量浓度Cd（33.72 mg/L）处理后活性显著升高，Caspase-3活性在一定Cd质量浓度范围内呈现出了明显的剂量-效应关系。这与河南华溪蟹鳃和肝胰腺组织中Caspase-3活性的变化规律有相同之处，也有区别性。

细胞凋亡经典的途径有2条，分别为细胞表面死亡受体途径和线粒体引发途径[29]。Caspase-8在细胞表面死亡受体途径中起到至关重要的作用，Caspase-8酶原前体通过细胞膜死亡受体作用，自我水解活化形成活化态Caspase-8，随即激活Caspase-3触发细胞凋亡发生[30]。Caspase-9在Caspase依赖性线粒体引发凋亡途径中发挥中心作用，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）及Caspase-9前体形成凋亡体，随即Caspase-9前体自剪切活化后激活Caspase-3触发细胞凋亡发生[31-32]。本试验结果表明，外套膜中Caspase-9活性在低质量浓度和高质量浓度Cd（8.43，67.45 mg/L）下显著下降；中高质量浓度Cd（16.86，33.72 mg/L）下活性显著升高，变化规律与Caspase-3活性基本保持一致。有研究表明，在Cd致小鼠肝脏组织细胞凋亡和Cd致河南华溪蟹肝胰腺组织细胞凋亡中，Caspase-9和Caspase-3活性变化表现出了高度的一致性[11，33]，本试验结果与之相似。揭示Cd致河蚌外套膜组织细胞凋亡途径可能是通过线粒体引发途径实现的。在中、高质量浓度Cd处理组，与对照组相比，外套膜中Caspase-8活性呈现出逐步显著增高的趋势，这与前者的研究结果不同，显示了物种的差异性。

有研究表明，Cd诱导引起的细胞凋亡与氧化损伤密切相关[34]，ROS在细胞凋亡早期发挥一定的作用，并可引起线粒体膜电位去极化[35-36]。其中，H2O2可以促使T淋巴细胞中细胞色素C释放和激活Caspase酶原而引发细胞凋亡[35]，诱导细胞凋亡因子Fas和FasL在肠上皮细胞中的表达，以触发细胞凋亡[37]。本试验结果显示，外套膜中H2O2含量随Cd质量浓度的增加而呈现出逐步显著增高的趋势，这与Cd致河南华溪蟹鳃组织中H2O2含量的变化规律相似[26]。同时，生物有机体为了拮抗氧化胁迫，会通过过量表达抗氧化酶来降低氧化损伤。有研究也证实，Cd在96 h可以显著诱导河蚌外套膜中SOD，CAT和GPX活性以应对氧化损伤，以消除组织中过量的H2O2[38]。

Caspase酶原被激活后，尤其是Caspase-3活化后可以通过酶解细胞凋亡抑制因子，裂解细胞外基质和细胞骨架及蛋白，酶解遗传物质修复因子，从而使细胞功能和形态发生一定的变化，包括细胞体积缩小，细胞质固缩，细胞器变形消失，细胞之间裂解分离，染色质凝聚及核碎裂等[39]。本试验结果表明，Cd在一定质量浓度范围内激活了Caspase酶活性，同时，致使外套膜组织细胞结构发生了不同程度的变化，表现出了细胞凋亡的细胞形态特征；细胞体积缩小，细胞内空泡化严重；微绒毛脱落消失；核膜水肿并折叠内陷，染色质严重浓缩并出芽裂解；线粒体嵴模糊并肿胀，空泡化严重。与已有的研究结果相似[11，28]。

Cd诱导的细胞凋亡包括Caspase依赖型[36]和Caspase非依赖型途径[40]，有研究显示，Cd致使有机体产生氧化损伤后，产生过量的ROS，在激活Caspase酶活性的同时也表现出了典型的细胞凋亡特征[41]。本试验结果表明，Cd促使外套膜组织中H2O2显著增加，Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9活性在一定程度上也显著升高，并表现了细胞凋亡的细胞形态特征。也有研究发现，H2O2可以通过Caspase依赖型途径促使细胞凋亡发生[35]。虽然，Cd不能直接导致有机体组织氧化损伤和细胞凋亡，但是Cd可以通过诱导的ROS-caspase级联反应-细胞凋亡信号通路触发凋亡[26]。因此，推测Cd处理河蚌后，Caspase依赖型途径触发的凋亡发生于河蚌外套膜组织中。H2O2作为活性氧自由基，一方面加重了外套膜组织的氧化损伤；另一方面可以作为信号分子激活Caspase酶活性并触发细胞凋亡。

综上所述，在Cd急性处理河蚌96 h后，外套膜受到氧化胁迫以后，产生大量的活性氧H2O2，并引发Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9活性在一定程度显著升高，触发组织细胞发生凋亡，并表现出典型的细胞凋亡形态特征。同时，推测Cd致河蚌外套膜组织细胞凋亡可能是通过线粒体引发途径实现的，Cd可以通过诱导ROS引起caspase级联反应后触发细胞凋亡。至于更详细的凋亡机制，仍需要后续进一步深入研究。

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Effects of Cadmium on Apoptosis-related Enzymes Activity and Cellularity Changes of the Mantle of Freshwater MusselAnodonta woodiana

LI Yongquan，YANGHuizhen，RENYujuan，WUHao，JINGWeixin，WANGLan
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This study examines the effects of cadmium（Cd）on the activities of apoptosis-related enzymes,the level of H2O2and ultrastructure ofthe mantle ofthe freshwater mussel Anodonta woodiana.The freshwater mussels were exposed todifferent concentrations ofCd（8.43,16.86,33.72,67.45 mg/L）for 96 h.Activities ofCaspase-3,8,9,as well as H2O2level were measured by enzymatic assays. The result showed that with the increase of Cd concentration,Caspase-3 activity decreased initially and increased subsequently（P＜0.05）.The change in Caspase-9 activity followed the similar pattern.The activity of Caspase-8 increased significantly after the mussels exposed to Cd in a dose-dependent manner（P＜0.05）.With the increase of Cd concentration,H2O2level increased gradually in a dose-dependent manner（P＜0.05）.Moreover,after Cd treatment（16.86,67.45 mg/L）for 96 h,histological abnormalities were observed by electronic microscopy in the mantle cells.After Cd treatment（16.86 mg/L）,the obvious changes of cellularity were shown by the followingfeatures:chromatin condensed near nuclear membrane,nuclear membrane swelled and ruptured;mitochondria became swelling and vacuolating gradually,and some mitochondrial crisae disintegrated;microvilli arranged disorderly,broke off and were decreased gradually,the vacuole appeared.After Cd treatment（67.45 mg/L）,the histological abnormalities were more apparent by the following features:most of chromatin condensed near nuclear membrane,nuclear membrane swelled and ruptured seriously;mitochondria became swelling and vacuolating,and most of mitochondrial crisae disintegrated;rough endoplasmic reticulum disintegrated,and formed many different sizes ofvesicles.In conclusion,Cd can cause significant changes in the enzymatic activities and histological abnormalities to the mantle ofthe animal.

Anodonta woodiana;mantle;caspase;cellularity;cadmium

X174

A

1002-2481（2016）08-1108-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.08.13

2016-05-25

山西省普通高校生物学特色重点学科建设项目（2011-SXDX-SWX-003）

李涌泉（1981-），男，山西大同人，讲师，主要从事水生生态毒理学教学及研究工作。王 兰为通信作者。