黑龙江省猪肉中四环素类药物残留检测及风险评估

韩美玉, 李 蕊, 金慧然, 关舒函, 李 睿, 张秀英

(1.东北农业大学动物医学学院 , 黑龙江哈尔滨150030 ； 2.黑龙江省兽药饲料监察所 , 黑龙江哈尔滨150069)

黑龙江省猪肉中四环素类药物残留检测及风险评估

韩美玉1, 2, 李 蕊2, 金慧然2, 关舒函1, 李 睿1, 张秀英1

(1.东北农业大学动物医学学院 , 黑龙江哈尔滨150030 ； 2.黑龙江省兽药饲料监察所 , 黑龙江哈尔滨150069)

本文用高效液相色谱串联质谱法对2015年3-10月在黑龙江省8个市、 县的超市、 屠宰场、 农贸市场随机采集的245份猪肉中3种四环素类药物(四环素、 土霉素、 金霉素)的残留水平进行了检测， 在此基础上对黑龙江省猪肉产品中四环素类药物的残留风险进行了评估。 结果显示， 在黑龙江省8个市县抽检的245份猪肉样本中未检出四霉素和土霉素的残留， 金霉素的检出率为2.85%， 金霉素残留范围为12.80 μg/kg～24.50 μg/kg， 均值为18.48 μg/kg， 未超过国家规定的最高残留限量(100 μg/kg)；金霉素是该批次抽检的猪肉样品中残留的主要四环素类药物； 黑龙江省猪肉产品中四环素类药物残留的食品安全指数均值为10.22×10-3， 最小值为7.11×10-3， 最大值为13.61×10-3， 远远低于1， 表明黑龙江省猪肉产品中四环素类药物的残留对人体的潜在危害水平是可以接受的， 不会对人群产生不良作用。

猪肉 ； 四环素类药物 ； 残留检测 ； 风险评估

四环素类(Tetracyclines，TCs)是由链霉菌产生或经半合成精制的一类碱性的广谱抗生素，属于抑菌剂，抗菌谱包括革兰阳性菌和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体[1]。其作用机制主要是通过阻止氨酰基与核糖核蛋白体的结合，阻止肽链的增长和蛋白质的合成，从而抑制细菌的生长，高浓度时也有杀菌作用。常见的TCs包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素[2]。可用于畜禽疾病的预防和治疗或者作为饲料添加剂来促进畜禽生长，但是由于一些养殖户对该类药物的不合理使用或滥用会导致动物性食品中残留问题，对人类健康造成影响，而且更加严重的是在畜禽产品中残留较低浓度的四环素类药物容易诱导各种致病菌产生耐药性，不利于对人类和动物疾病的治疗[3]。为此，我国和欧盟等国际组织规定所有可食用动物肌肉组织中四环素、土霉素和金霉素的最高残留限量为100 μg/kg。因此，检测和分析畜禽产品中土霉素、金霉素和四环素的残留是十分必要的。

本研究以黑龙江省为研究区域，随机抽检省内8个市、县共计245份猪肉样本，对这些猪肉样本中四环素类药物的残留水平及风险水平进行研究，目的是为引导消费和科学监管提供数据支撑和科学依据。

1 材料

1.1 材料来源 于2015年3月-10月，以黑龙江省8个市、县(哈尔滨市，齐齐哈尔市，佳木斯市，大庆市，鸡西市，牡丹江市，阿城区，宾县)作为采样区域，每个区域内随机选择超市、农贸市场以及屠宰场作为采样点进行猪肉样品采集，每份猪肉样品500 g左右，共计采集245份。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂 甲酸、乙腈为色谱纯(Fisher公司)；甲酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸二氢钠均为分析纯(天津科密欧化学试剂开发中心)；试验用水为一级水。四环素类药物标准品：四环素、金霉素、土霉素(含量大于99.0%，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司生产)。

1.2.2 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾、离子源，型号为WatersAcquityUPLC-AcquityTQD)，美国Waters公司；固相萃取装置(型号：5982-9124)，美国安捷伦公司生产；均质机(型号：AM-9)，上海季诺科贸有限公司生产；高速离心机，德国Biofuge公司生产；旋转蒸发仪，德国Heidolph公司生产；氮气吹干仪(型号：OA-SYS)，美国Organomation公司生产；涡旋振荡器(型号：VX-Ⅲ)，北京踏锦科技有限公司生产；电子分析天平(型号：AE-249)，梅特勒仪器(上海)有限公司生产。

1.2.3 标准溶液配制 (1)标准储备液：精密称取四环素、金霉素、土霉素标准品共10 mg，用甲醇溶解在100 mL容量瓶并定容至刻度，配制成浓度100.0 μg/mL的标准储备液，置于-20℃冰箱中保存，有效期为1个月；(2)混合标准工作液：精密量取标准储备液10 mL，用甲醇-水(3+7，V/V)溶液稀释在100 mL容量瓶并定容至100 mL，配置成浓度为10.0 μg/mL的系列混合标准工作液，现用现配。

2 方法

2.1 样品前处理 样品前处理按农业部1025号公告-12-2008《鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测液相色谱-串联质谱法》对猪肉样品中的四环素类药物(四环素、土霉素、金霉素)进行萃取和净化[4]。

2.2 检测方法 采用液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对待测样本进行检测[5]。

2.2.1 仪器条件 色谱条件：超高效液相色谱的色谱柱为WatersBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。流动相A为0.3%甲酸乙腈溶液；B为0.3%甲酸水溶液，柱温为20 ℃，流速为200 μL/min，进样量为20 μL；洗脱梯度见表1。

表1 分离3种四环素类药物的洗脱梯度

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；多反应离子监测(MRM)。毛细管电压为3.0 kV；离子源温度110 ℃；雾化温度350 ℃；雾化气流速为650 L/h；锥孔气流速为50 L/h。

2.2.2 最低检测限与最低定量限 向空白猪肉样本中添加标准溶液确定最低检出限和最低定量限。信噪比S/N>3者定为方法的检测限；信噪比S/N>10者定为方法的定量限[6]。

2.2.3 标准曲线制备 精密吸取10 μg/mL浓度的四环素混合标准工作液，用流动相分别稀释至浓度为10、20、50、100、200、400 ng/mL的混合标准工作液。将配好的系列混合工作液由低浓度到高浓度依次进样，以标准溶液浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

2.2.4 准确率与精密度测定 取空白猪肉，每份质量为2±0.02g，分别添加50、100μg/kg和200μg/kg(即1/2的MRLVDs，MRLVDs和2倍的MRLVDs)3个浓度水平的标准溶液，各浓度进行5个平行试验，重复3次，按上述条件进行测定，计算回收率及相对标准偏差RSD，根据回收率用来考察本试验的准确度，根据相对标准差考察本试验的精密度。

2.2.5 猪肉中四环素类药物残留的检测 对黑龙江省8个市、县随机采集的245份猪肉样本，经前处理方法处理后，采用高效液相色谱串联质谱法进行测定。

2.3 猪肉中四环素类药物残留的风险评估 本文采用食品安全指数[7]对猪产品中四环素类药物的残留风险进行评估[7]，计算公式：IFS=(R×F)/(SI×bw)

公式中，IFS为食品安全指数；R为猪肉样品中四环素类药物的残留浓度(μg/kg)；F为人们每日猪肉消费量(kg/person·d)。根据中国肉类协会2015年的统计数据显示，2014年中国人均猪肉消费量为41.5 kg，因此，本文中F值按0.1 kg/person·d计算(41.5/365=0.114 kg)；SI为四环素类药物的ADI(每日允许摄入量)值[8]，其中，金霉素SI值为3 μg/kg·d；体重为人体平均体重(kg)，文中按 60 kg 计算。

IFS小于1表示所检测的四环素类药物对人们的健康造成的危害效应并不明显，所检测的四环素类药物对人们健康的风险是可以接受的，不会造成危害效应；IFS大于1表示所检测的四环素药物对人们健康的风险超出了可接受的限度，所检测的四环素药物对人们的健康造成的危害效应是明显的，出现这种情况就应该进入风险管理程序了[9]。

3 结果

3.1 标准曲线和线性范围 在选定的色谱条件下测定，四环素、金霉素和土霉素在10～400 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系(表2)，R2均大于0.999(y为峰面积，x为待测组分的浓度，μg/kg)。

3.2 检测限与定量限 在上述方法操作条件下，根据信噪比理论测得3种四环素类药物在猪肉中的检测限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。标准溶液和空白猪肉中四环素类药物特征离子质量色谱图见图1～2。

表2 四环素类药物的回归方程和相关系数

图1 标准溶液

图2 猪肉空白样品

3.3 方法的准确度和精密度 在空白猪肉组织中添加3个不同浓度四环素类药物进行回收率试验，计算出回收率和精密度见表3，可以看出3种药物平均回收率(n=5)为73.6%～106.8%，批内平均RSD为3.6%～7.9%，批间平均RSD为1.8%～3.6%。

3.4 猪肉样品中四环素类药物的残留水平 黑龙江省猪肉样品中四环素类药物的残留水平如表4所示。黑龙江省猪肉产品245份样品中没有检出四环素和土霉素，检出金霉素7份，检出率为2.85%。金霉素残留范围为12.80～24.50 μg/kg，均值为18.48 μg/kg，未超过国家规定的最高残留限量100 μg/kg(农业部235号公告)。

表3 猪肉组织中添加四环素类药物精确度和回收率测定结果 n=5

表4 黑龙江省猪肉产品中四环素类药物的残留水平

ND：未检出

3.5 猪肉产品中四环素类药物残留的风险评估

黑龙江省猪肉样品中四环类药物残留的及食品安全指数如表5所示。人们摄食黑龙江省猪肉产品的每日暴露量的均值为0.030 6 μg/k体重·d，最大值为0.040 8 μg/k体重·d，最小值为0.021 3 μg/k体重·d，远低于最大允许摄入量(3 μg/k体重·d)；黑龙江省猪肉样品中四环素类药物残留的食品安全指数均值为1.70×10-3，最小值为1.18×10-3，最大值为2.26×10-3，远远低于1。这表明黑龙江省猪肉样品中四环素类药物的残留对人体的潜在危害水平是可以接受的，不会对人群产生不良作用，相关部门不必进入风险管理程序[10]。

表5 四环素类药物的每日膳食暴露量及食品安全指数

4 讨论

2015年3月-10月，采用高效液相色谱串联质谱法对黑龙江省内八个市、县的猪肉组织中的四环素、土霉素和金霉素3种四环素类药物残留进行抽检，同时对黑龙江省猪肉产品中四环素类药物的残留风险进行了评估，检测结果说明，黑龙江省内猪肉中四环素类药物残留问题比较小。抽检八个市中齐齐哈尔，大庆和牡丹江3个市虽然均检出有四环素类药物残留，但均未超过国家规定的最大残留限量。哈尔滨、佳木斯、鸡西、阿城和宾县五个区域均未检出四环素类药物残留。这说明黑龙江省猪肉产品中未造成四环素类药物残留超标问题[11]。

一般采用食品安全指数(IFS)来描述人们对摄入的食物中所要评估的化学目标物是否对人体具有潜在危害，并能用此结果对食用该食品的安全状态做一个说明， 从而知道风险管理者对其采取相应的方法手段。在本研究中，通过食品安全指数的分析，结果表明，黑龙江省猪肉产品中四环素类药物残留的食品安全指数均值为10.22×10-3，最小值为7.11×10-3，最大值为13.61×10-3，远远低于1，表明黑龙江省猪肉产品中四环素类药物的残留对人体的潜在危害水平是可以接受的，不会对人群产生不良作用。相关部门不必进入风险管理程序。

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Detection of tetracycline drugs residue in the pork of Heilongjiang province and its risk assessment

HAN Mei-yu1.2, LI Rui2, JIN Hui-ran2, GUAN Shu-han1, LI Rui1, ZHANG Xiu-ying1

(1.School of Veterinary Medicine ， Northeast Agricultural University ， Harbin 150030，China;2.Veterinary Medicine Feed Supervision in Heilongjiang province ， Harbin 150069，China)

High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used for determination of residues of the three tetracycline drugs (tetracycline， oxytetracycline and chlortetracycline) in 245 pork samples collected randomly in the supermarkets， slaughterhouses， and farmers’ markets from eight cities and counties of Heilongjiang province during a period of 3 ～ 10 months in 2015， to evaluate the risk of tetracycline residues in pork products in Heilongjiang province.The results showed that tetracycline and oxytetracycline residues were not detected but chlortetracycline residues were detected at a rate of 2.85%. Chlortetracycline residues ranged from 12.80 μg/kg to 12.80 μg/kg with an average value of 18.48 μg/kg， not exceeding the maximum residue limits set by the state (100μg/kg).Thus we found that chlortetracycline was the main residue of tetracycline drugs in the pork samples.The average value of food safety index in pork products related to tetracyclines residues in Heilongjiang province was 10.22×10-3， the minimum value is 7.11×10-3， and the maximum was 13.61×10-3， which is,far below 1. Our findings suggest that the potential hazard level of tetracycline residues in pork products in Heilongjiang province is acceptable.

Pork; Tetracycline drugs; residue detection; risk assessment

ZHANG Xiu-ying

2015-13-31

韩美玉(1990-)，女，硕士生，研究方向为兽医药理学与毒理学研究，E-mail：1838006476@qq.com

张秀英，E-mail：zhangxiuying@neau.edu.cn

S859.84

A

0529-6005(2016)11-0096-04