血浆对氧磷酶1在奶牛酮病中的变化及其预测作用

曹 宇 ， 张 江 ， 杨 威 ， 夏 成 ， 张洪友 ， 王艳辉 ， 徐 闯

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 黑龙江大庆163319)

血浆对氧磷酶1在奶牛酮病中的变化及其预测作用

曹 宇 ， 张 江 ， 杨 威 ， 夏 成 ， 张洪友 ， 王艳辉 ， 徐 闯

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 黑龙江大庆163319)

为了早期预测奶牛酮病的发生， 随机选取黑龙江某集约化牛场， 产后14～21 d奶牛为试验动物。 通过对氧磷酶1(PON1)、 葡萄糖(GLU)、 游离脂肪酸(NEFA)、 β-羟丁酸(BHBA)和谷草转氨酶(AST)的检测， 阐明奶牛围产期PON1在奶牛酮病发生风险的预警作用。 结果表明， 酮病组较对照组奶牛血浆中PON1活性和含量显著下降。 PON1含量、 活性与GLU、 BHBA、 NEFA和AST均有显著相关性。 根据受试者工作特征曲线(ROC)分析确定酮病预测值为血浆PON1含量>46.79 nmol/L、 GLU>3.04 mmol/L、 AST<100 U/L、 NEFA>0.82 mmol/L。 试验表明，PON1、 GLU、 AST和NEFA均可用作预测奶牛酮病发生风险的评估指标。

奶牛； 酮病； 对氧磷酶-1； 相关分析； ROC分析

酮病是奶牛围产期常见的危害较为严重的营养代谢病，其临床主要表现为酮血症、酮尿症和酮乳症[1]。国际上公认的奶牛酮病诊断的金标准是血浆β-羟丁酸(BHBA)≥1.2 mmol/L[2]。较多文献还报道了奶牛酮病、肝功异常与奶牛脂肪肝发生密切相关。当奶牛酮病围产期发生率越高、血浆BHBA浓度升高越多(2.50 mmol/L以上)，肝功酶活性越高(AST>100 U/L)，奶牛脂肪肝发生率也越高[3]。

PON1是一种钙依赖性酶，主要经肝脏分泌入血。最新的文献报道血中PON1活性降低对奶牛脂肪肝具有良好的诊断价值[4]。本试验通过检测围产后期酮病奶牛和AST高的试验牛血浆中PON1活性和含量以及相关生化指标，阐明血浆PON1对产后酮病发生风险的预测作用，为及早预防奶牛酮病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与血液样本采集 在黑龙江某地采用自由卧栏、TMR饲喂以及具有完善牛场管理软件的集约化奶牛场中开展试验。选取年龄2～4岁，胎次1～3次，产后14～21d健康奶牛21头，酮病奶牛17头。

试验奶牛于清晨采血时间点空腹进行尾静脉采血10 mL，加入150 IU肝素抗凝，于30 min内离心分离血浆(5 000 r/min离心5 min)，血浆分装后置于 -80 ℃ 冰柜冷冻保存。

1.2 检测指标与统计分析 血浆PON1活性使用血液PON1有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒检测，PON1含量使用牛PON1酶联免疫分析测定(均购自上海哈灵科技有限公司)。β-羟丁酸、游离脂肪酸、谷草转氨酶和血糖(以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)。

试验数据使用IBM SPSS 19.0软件进行统计分析，各组试验数据进行独立样本t检验分析，相关性利用皮尔逊相关系数分析，疾病预测利用二元回归分析，诊断效果以及分界值的确定利用ROC分析。

2 结果

2.1 试验奶牛血液生化指标的比较 由表1可知，酮病组较对照组奶牛血浆中PON1活性显著下降；PON1含量和GLU含量极显著下降；AST、BHBA和NEFA含量极显著升高。

表1 试验奶牛血液生化指标的比较

2.2 奶牛PON1与血液各生化指标的相关性 由表2可知PON1含量与PON1活性和葡萄糖呈极显著正相关；与AST呈显著负相关；与BHBA和NEFA呈极显著负相关。PON1活性与PON1含量和GLU呈极显著正相关；与AST和BHBA呈极显著负相关。

表2 奶牛PON1与血液各生化指标的相关性

*：差异显著， P<0.05； **差异极显著,P<0.01

3 泌乳奶牛酮病的风险预测

表2和中插彩版图1显示了奶牛酮病预警的相关指标分界值、敏感度和特异性。通过Youden指数确定的最佳分界值分别为血浆PON1含量>46.79 nmol/L，GLU>3.04 mmol/L，AST<100 U/L，NEFA<0.82 mmol/L；敏感度分别为87.50%、93.80%、100%和75%，特异度分别为100%、83.3%、82.4%、94.1%。曲线下面积分别为0.953、0.929、0.941和0.894。

表3 分界值、敏感度、特异度阴性预测值、阳性预测值、阳性依然比、阴性依然比和ROC曲线下面积

4 讨论

本研究显示，酮病组奶牛血中PON1活性和含量较正常组均显著降低，并与BHBA呈显著负相关。这可能是围产期奶牛由于能量输出较大而得不到充分的能量补给而引起奶牛处于能量负平衡状态，体脂动员产生大量的脂肪酸在肝脏肝线粒体和内质网β氧化过程中会产生大量的活性氧(ROS)[5]。过多的ROS和自由基耗竭抗氧化因子，使促氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调，导致脂质过氧化，就容易导致氧化应激状态[6]。脂质过氧化物可产生大量具有反应活性和细胞毒性的中间产物，导致肝细胞死亡、坏死，并通过细胞损伤产生炎症反应或吸引炎症细胞浸润肝实质[7]。当肝脏损伤时，肝脏合成PON1减少，血中PON1活性会下降。这可能与机体氧化应激与PON1活性成反比有关[8]。另外，NEFA本身就具有肝细胞毒性，通过增强肿瘤坏死因子等细胞因子的毒性，引起线粒体肿胀与通透性增加、肝细胞变性、坏死或凋亡[9]。本试验NEFA与PON1含量呈显著负相关，这与以往的研究一致，PON1可能对奶牛脂肪肝具有一定的诊断作用[4]。同时，血中AST活性却显著的升高，PON1与AST存在显著的负相关。这是由于AST存在于多种器官的细胞的胞浆或线粒体内且尤以肝脏、心肌和骨骼肌中活性最高。当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞浆中酶释放入血，血中酶活性会升高。因此，AST常作为肝脂沉积的标志物来诊断脂肪肝[10]。

本试验初步对奶牛酮病相关指标进行了预测，结果显示，PON1含量应高于46.79 nmol/L；GLU高于3.04 mmol/L；AST不应高于100 U/ml；NEFA不应高于0.82 mmol/L，试验表明，PON1、GLU、AST和NEFA均可用作预测奶牛酮病发生风险的评估指标。

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Warning Value of Plasma PON1 in Dairy Cows with Ketosis

CAO Yu, ZHANG Jiang, YANG Wei, XIA Cheng, ZHANG Hong-you, WANG Yan-hui, XU Chuang

(Collge of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319，China)

In order to predict early cow ketosis,postpartum dairy cows were randomly selected as experimental animals in Heilongjiang.Biochemical assay was used to determine PON1, GLU, NEFA, BHBA and AST to clarify the role of PON1 in the risk of ketosis in dairy cows. Results indicated that PON1 activity and level of PON1 were significantly decreased when compared with the control group(P<0.05). The activity of serum PON1 and level of PON1 were significantly correlated with the level of plasma GLU, AST and BHBA. According to the receiver operating characteristic curve (ROC) analysis, the ketosis warning values of plasma PON-1 content is more than 46.79 nmol/L, GLU is more than 3.04 mmol/L, AST is less then 100 U/L and NEFA is less than 0.82 mmol/L.This study verifv that the levels of PON1, GLU, AST and NEFA could be used as indicators to predict the risk of ketosis for dairy cows.

Dairy cow; Ketosis; PON-1; Correlation Analysis; Receiver Operating Characteristic

ZHANG Hong-you

2016-03-16.

国家科技部计划项目(2012BAD12B05-2；2012BAD12B03-2；2013BAD21B01)；霍英东教育基金会高等院校青年教师基金(141021)

曹宇(1991- )，男，硕士生，研究方向为临床兽医学，E-mail：1015009909@qq.com

张洪友，E-mail: zhy478@163.com

S823.91

A

0529-6005(2016)11-0038-02