星点设计-效应面法优化酿酒酵母活性蛋白提取工艺

王兴华，杨文飞

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

星点设计-效应面法优化酿酒酵母活性蛋白提取工艺

王兴华1，杨文飞2

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

采用星点设计-效应面法优化酿酒酵母活性蛋白提取工艺，为进一步研究酿酒酵母提供理论依据。以超声波破壁法提取酿酒酵母活性蛋白，采用单因素试验和星点试验设计，研究超声总时间、工作时间/间歇时间、超声功率对酿酒酵母活性蛋白得率的影响。结果表明，酿酒酵母活性蛋白提取最佳工艺：超声总时间为15.32 min，工作时间/间歇时间为17.96 s/17.96 s，超声功率为461.45 W，期望值37.53 μg/mL；按最佳提取条件提取后测得的实际蛋白含量为36.48 μg/mL。星点设计-效应面法优化超声波破壁法提取酿酒酵母活性蛋白工艺，方法简便，预测性良好。

星点设计；超声破壁；酿酒酵母；活性蛋白

早在1996年真核生物酿酒酵母基因组测序便率先完成。酵母细胞是目前被人们了解最多的生物之一，也是生物界的模式生物之一，在很多方面都有一定的研究应用[1]。它富含的人体必需8种氨基酸的组成比例接近联合国粮农组织（FAO）推荐的理想氨基酸的比例。近些年来，酵母提取物需求量也开始呈现不断上升的趋势[2-4]。

酵母细胞壁是由葡聚糖和甘露糖蛋白组成的位于酵母细胞最外层的一层保护层，对维持细胞渗透压，保护细胞免受外部伤害起着重要作用。酵母细胞壁的存在极大地影响酵母蛋白被利用，且已经有很多学者对如何进行酵母破壁做了大量的研究工作。使酵母细胞破壁释放蛋白质的方法，有反复冻融法、化学法、酶解法和机械破壁法等[5-8]。超声波破壁法是其中广泛应用的一种方法，通过在溶剂中产生的振动、搅拌和空化作用使细胞破裂，进而使其有效成分溶出[9-11]。李聪等[12]研究表明，超声破碎酵母细胞法与其他方法相比，更为简便、快捷、经济、实用，而且可以在保证其提取率的前提下保护所提取蛋白的活性。

国际上在工艺优化时，常使用均匀设计和正交设计，但这2种试验方法在精度和数学模型预测能力方面较差。近几年，国外常运用将数学和统计学方法融于一体的效应面优化法（Response Surface Methodology，RSM）进行设计优化[13-15]，其精度高、预测能力好，是目前常用的设计方法[16]。星点设计（Central Composite Design，CCD）是在析因设计的基础上，由析因点及中心点而形成的可进行线性或非线性拟合的试验设计方法，由于其试验精度高、试验次数少及预测值接近真实值等特点，近年来常用于优化设计。

本试验利用星点设计来优化超声波破壁法提取酿酒酵母活性蛋白的工艺，旨在为酿酒酵母活性蛋白的研究及应用提供一定科学依据。

1 材料和方法

1.1 菌株

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EGY48菌株保存于山西大学生命科学学院。

1.2 试剂

YPD培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH自然。考马斯亮蓝试剂和标准蛋白质溶液，参照赵卓等[17]的方法进行配制。

1.3 仪器

THZ-82A恒温振荡器，上海跃进医疗器械有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 酿酒酵母蛋白提取及测定

挑取保存于固体培养基上的酵母单菌落于YPD液体培养基中，30℃，200 r/min振荡培养过夜；取适量活化的菌液接种到新的YPD培养液中，培养至对数期后于4℃收集菌体，稀释至106个/mL后按给定条件进行超声波处理，取超声处理后的菌悬液适量，低温离心15 min（4℃，1 000 r/min）后取上清液得粗提液，然后用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。

1.5 总工作时间对酿酒酵母蛋白含量的影响

为了降低对超声波细胞破碎仪的耗损，选定其破碎功率为325 W、工作时间/间歇时间为1 s/1 s，并设定超声破碎细胞时间分别为10，20，30，40，50，70 min。破碎后离心取上清，提取酵母蛋白，最后测定蛋白含量。

1.6 工作时间/间歇时间对酿酒酵母蛋白含量的影响

工作时间/间歇时间在超声破碎过程中不仅影响细胞破碎率，而且影响目的蛋白的活性[12]。破碎功率设定为325 W、总工作时间设定为10 min，设定工作时间/间歇时间分别为5 s/5 s，10 s/10 s，15 s/15 s，20 s/20 s，25 s/25 s进行超声细胞破碎，然后离心取上清，提取酵母蛋白，最后测定蛋白含量。

1.7 超声破碎功率的确定

超声破碎功率的大小会影响细胞破碎的完全度及样品的蛋白活性[12]。工作时间/间歇时间设定为1 s/1 s，总工作时间设定为10 min，超声功率分别以130，260，390，520，650 W进行细胞破碎，然后离心取上清，提取酵母蛋白，最后测定蛋白含量。

1.8 星点设计-效应面法对超声破壁条件的优化

在单因素考察的基础上，以超声总时间（X1，min）、工作时间（X2，s）及功率（X3，W）作为考察因素，粗提液蛋白含量作为考察指标，进行3因素5水平的星点设计。应用Design-Expert 6.0.5软件进行数据拟合，以±1.68，±1，0代表自变量水平。试验设计列于表1。

表1 因素水平设计

2 结果与分析

2.1 超声波功率对提取酿酒酵母蛋白的影响

从图1可以看出，当破碎功率为260～520 W时，提取到的蛋白含量变化趋势较130～260 W变小且趋于平直。而当超声波功率大于520 W时又开始出现显著的上升趋势，考虑到用考马斯亮蓝测定蛋白含量时，溶液吸光值会随蛋白变性而上升[17-20]，本研究认为第2次开始呈现出上升趋势时，蛋白已经开始变性。所以，在后续试验中选择破碎功率在390～520 W来进行优化。

2.2工作时间/间歇时间对提取酿酒酵母蛋白的影响

从图2可以看出，在一定范围内，随着工作时间/间歇时间的增大，样品提取液中蛋白含量逐步增高；当工作时间/间歇时间为20 s/20 s时，蛋白含量达到2.1中520 W超声处理后的水平；且在20 s/20 s～25 s/25 s蛋白含量变化的不大。因此，选择工作时间/间歇时间为20 s/20 s左右进行超声破碎。

2.3 超声总时间对酿酒酵母活性蛋白提取的影响

从图3可以看出，在一定范围内，随着总工作时间的增加，粗提液蛋白含量逐渐升高，且在20 min时蛋白水平已达到2.2中最高水平。因此，选择小于10～20 min的时间段进行优化超声破碎。

2.4 星点设计试验设计与结果

通过Design Expert 6.0.5软件生成20组试验组合，试验设计和结果列于表2。

表2 试验设计与结果

以粗酶液蛋白含量为响应值，对各因素进行回归拟合，得到响应值Y和各因子之间的回归方程：Y＝2.25X1＋0.798X2＋0.177X3－92.9，该方程P＜0.000 1，R2＝0.916，所以，该模型是显著的，可用来预测超声破碎酿酒酵母细胞壁提取活性蛋白的最佳提取工艺。该模型的方差分析结果如表3所示。

由表3可知，模型各项差异均极显著，可见超声总时间、工作时间/间歇时间和超声功率对活性蛋白提取量的主效应明显。并且依据系数值X1＝610.05，X2＝76.95，X3＝639.4，可知因素的主效应关系为：超声功率＞超声总时间＞工作时间/间歇时间。

表3 响应面模型的方差分析结果

2.5 提取工艺条件的验证

由于在单因素确定阶段，在37.53μg/mL之前蛋白含量的变化趋势已经趋于稳定，且大于37.53μg/mL后的值开始急剧增大，考虑到过度的破碎可能会引起蛋白质失去活性，而在生化测验中需要用有活性的蛋白质，故本研究在优化的时候没有选取最大值，而是以37.53 μg/mL为目标值进行优化，以得到最多的活性蛋白。

由软件分析得到最佳提取条件：X1＝15.32 min，X2＝17.96 s/17.96 s，X3＝461.45 W，期望值Y＝37.53 μg/mL（图4）；按给出的最佳提取条件提取后测得的平均蛋白含量为36.48 μg/mL（n＝3），与预测值接近，说明了愿望函数优化所得到的理论最佳工艺的可行性和有效性。

3 讨论

本研究以酿酒酵母活性蛋白含量为指标，将超声破碎功率、工作时间/间歇时间及总工作时间列为考察因素，通过单因素试验及星点设计探究酵母细胞的最佳条件。考虑到考马斯亮蓝法具有灵敏度高、测定快速、稳定性好、干扰物质少等优点[21-22]，所以，在测定蛋白含量时选择考马斯亮蓝法，但是考马斯亮蓝会与蛋白变性后暴露出来的基团反应致使测定值变大[20]，故在进行期望函数优化时没有选择最大值而是选择一个恰当的值来进行优化，最后得出在提取的过程中，对粗提液蛋白含量影响程度为超声功率＞超声总时间＞工作时间/间歇时间，这与屈慧鸽等[23]的结论一致，试验优化后的超声破碎条件为超声功率461.45 W，总工作时间15.32 min，工作时间/间歇时间17.96 s/17.96 s。按给出的最佳提取条件提取后测得的实际蛋白含量为36.48 μg/mL，与预测值接近，说明了用星点设计优化所得的理论最佳工艺的可行性和有效性。

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Optimization of Active Protein Extraction from Saccharomyces cerevisiaeby Central Composite Design-response Surface Method

WANGXinghua1，YANGWenfei2
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This experiment was to optimize Saccharomyces cerevisiae active protein extraction process with central composite design-response surface method,provide theoretical basis for further research on Saccharomyces cerevisiae.This experiment extracted Saccharomyces cerevisiae active protein with ultrasonic wall-breaking method,using the single factor experiment and the star design,to study the influence of ultrasonic power,working time/pause time and total time on the yield of protein from Saccharomyces cerevisiae activity.The result showed that optimal extraction process on Saccharomyces cerevisiae active protein,was ultrasonic total time of 15.32 min,working time/pause time 17.96 s/17.96 s,ultrasonic power 461.45 W,and the expected value was 37.53 μg/mL,actual protein concentration was 36.48 μg/mL after the extraction of the best extraction conditions.To optimize the ultrasonic wall-breaking method to extract the Saccharomyces cerevisiae active protein with central composite design-response surface method,the method is simple and has a good predictability.

central composite design;ultrasonic wall-breaking;Saccharomyces cerevisiae;active protein

TS261.1＋1

A

1002-2481（2016）11-1715-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.33

2016-08-04

山西省科技攻关项目（20140311021-5）

王兴华（1958-），男，天津人，副教授，主要从事微生物代谢与发酵工程研究工作。