某奶牛场牛乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性调查

韩淑芳，刘一飞，王国艳，王志宇，马馨，梁佶宇，李希

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

某奶牛场牛乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性调查

韩淑芳，刘一飞，王国艳，王志宇，马馨，梁佶宇，李希

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

从山西某奶牛场随机采集25份奶样，进行细菌分离培养、染色镜检、H2O2酶试验鉴定，并对其进行了9种药物的敏感性试验。结果表明，从25份奶样中分离出18株金黄色葡萄球菌；这18株金黄色葡萄球菌对多种药物呈现出耐药性，其中，对阿莫西林耐药率最高，达77.8%，对卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、磷霉素、头孢曲松的耐药率介于11.1%～44.4%，对左氧氟沙星的耐药率最低，为5.6%。说明金黄色葡萄球菌为该奶牛场奶牛乳房炎的主要致病菌，该场奶牛对9种抗生素产生了普遍的耐药性，建议该奶牛场以体外药物敏感试验为参考，进一步扩大药物的筛选范围，选择更多敏感药物进行治疗。

牛乳；金黄色葡萄球菌；分离鉴定；耐药性

奶牛乳房炎是当前奶牛群中普遍流行的疾病，业已成为导致奶牛业严重损失的主要疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原菌种类较为复杂，常因地域、季节及饲养管理水平的差异而呈现出不同种类、不同比例的病原菌感染。而金黄色葡萄球菌目前仍是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，甚至占到奶牛乳房炎中病原体的50%以上[1]。奶牛乳房感染金黄色葡萄球菌常导致奶牛产生急性、亚急性和慢性感染症状。据报道，在奶牛场中，临床型乳房炎的发病率为2%～8%，隐性乳房炎的发病率更高，并且难以自愈[2-3]。该菌属可侵害奶牛乳房上皮细胞引起严重的纤维性炎症，并影响腺泡的分泌功能，使产奶量急剧下降；还可产生多种毒素污染乳汁，经煮沸消毒仍不能将其灭活。饮用金黄色葡萄球菌污染的牛奶，会导致剧烈的呕吐、腹泻和发热病症。因此，该菌的传播对奶牛健康和食品安全造成了严重威胁[3-9]。

目前，临床治疗金黄色葡萄球菌感染的主要措施仍是运用各类抗生素，但由于抗生素的超剂量和频繁使用，使其耐药谱不断扩大，产生的多重耐药情况越来越普遍，常使得临床治疗面临无药可用的困境，进而导致其将耐药性由奶源传递给人类，给公共卫生带来严重隐患[5，10-14]。

本研究从山西省某奶牛场送检的25份牛乳中，经细菌培养和染色镜检初步分离出18株金黄色葡萄球菌，并对其进行了药敏试验，旨在了解该奶牛场流行菌株的耐药情况，并为临床治疗奶牛乳房炎的抗生素筛选提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

乳样：山西省某奶牛场送检的分别从25头疑患乳房炎的奶牛采集到的25份牛乳各5～10 mL。

菌株：质控菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923），购自中国兽医药品监察所。

培养基：普通琼脂平板、营养肉汤，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；血液琼脂平板，购自郑州安图生物工程股份有限公司。

药敏纸片：其包括环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素共9种，购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 乳样细菌的分离培养和形态观察无菌吸取0.5 mL各乳样，分别加入5 mL的肉汤培养液中，于37℃温箱培养18～24 h，观察肉汤浊度。再用接种环蘸取菌液划线接种于普通琼脂平板，37℃培养18～24 h，观察菌落颜色、形态。挑取疑似葡萄球菌的优势菌落再次划线接种于血液琼脂平板，37℃培养18～24 h，观察溶血情况并经革兰氏染色后镜检。

1.2.2 过氧化氢酶试验用接种环挑取染色镜检后的疑似菌落涂抹于载玻片上，在其上滴加2～3滴3%的H2O2，观察有无气泡产生。

1.2.3 金黄色葡萄球菌的药物敏感试验采用K-B纸片扩散法对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素等9种药物进行药敏试验，37℃培养18～24 h后量取抑菌圈直径，其结果根据美国临床实验室国家标准化委员会（NCCLS）制定标准判读。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

普通肉汤中呈现出明显的浑浊，有沉淀，且在管壁形成菌环。普通琼脂平板上生长的菌落呈圆形、湿润、不透明、边缘整齐、表面隆起光滑，颜色呈柠檬色或黄色（图1）。将琼脂平板上的优势菌落接种血液琼脂平板后，未见形成明显的β溶血环（图2）。初步分离出18株金黄色葡萄球菌。

2.2 染色镜检结果

分离菌落经染色镜检，可见不规则排列成葡萄串样的革兰氏阳性球菌（图3）。

2.3 H2O2酶试验结果

受试的18株菌落均产生气泡，说明18株菌均为H2O2酶阳性。

2.4 药物敏感试验结果

表118 株金黄色葡萄球菌药敏试验结果

分别对18株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果依据美国临床实验室标准委员会（NCCLS）制定的标准判断，即抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感，16mm＜直径＜20mm为中度敏感，直径≤16 mm为耐药。由表1可知，分离的18株金黄色葡萄球菌对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、庆大霉素均呈现出不同程度的耐药性。其中，分离菌株对阿莫西林的耐药率最高，达77.8%，对左氧氟沙星的耐药率最低，为5.6%，对其余7种抗生素的耐药性介于11.1%～44.4%。

3 讨论与结论

本试验通过细菌的分离培养、染色镜检、过氧化氢酶等试验方法对25份奶样中的金黄色葡萄球菌进行了初步分离鉴定。结合菌落在平板上的金黄色菌落、染色镜检呈阳性葡萄串样、过氧化氢酶试验阳性的结果，初步认定试验分离出18株金黄色葡萄球菌，推测其是引起该场奶牛乳房炎的优势菌株。但分离菌株在血琼脂平板培养后，并未形成明显的β溶血环。由于大多数致病性金黄色葡萄球菌经血琼脂平板培养后均呈现β溶血环[15]，本试验的分离菌株是否为致病性菌株还有待后续开展分离菌株的致病性试验进一步检测。

本试验的药敏结果显示，分离出的18株金黄色葡萄球菌除对左氧氟沙星耐药率最低（5.6%）外，对环丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、头孢曲松、庆大霉素都呈现出不同程度的耐药性，其中，阿莫西林的耐药率最高（77.8%）。这与王冰等[16]报道的呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对阿莫西林产生耐药性最多的结果相近。对卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星的耐药性居其次（44.4%，38.9%，33.3%），高于王桂琴等[17]报道的卡那霉素耐药率（26%）和阿米卡星耐药率（6%），高于锡林高娃等[18]报道的庆大霉素耐药率（0），其余抗生素如环丙沙星、氧氟沙星、头孢曲松的耐药率在16.7%～22.2%，与王桂琴等[17]报道的环丙沙星、氧氟沙星、头孢曲松耐药率（12%，12%，14%）相近，但显著高于锡林高娃[18]报道的环丙沙星、氧氟沙星耐药率（0，4.2%），与高延玲等[19]报道的头孢曲松耐药率（13.4%）相近，但低于氧氟沙星耐药率（25.6%）。此外，本试验还选用了临床上较少使用的磷霉素进行药敏试验，结果显示，分离菌株对磷霉素也产生了一定的耐药性，耐药率为11.1%。本试验中耐药率最低的是左氧氟沙星，18株金黄色葡萄球菌分离株中仅有1株耐药，耐药率为5.6%，与赖金伦等[20]试验结果较为一致。提示左氧氟沙星可作为治疗该奶牛场奶牛乳房炎的备选药物。

由于本试验所分离菌株的数量相对较少，且与各相关报道中的受试菌株基数也不尽一致，导致金黄色葡萄球菌对各抗生素的耐药率与相关报道存在一定的差异。因此，本试验结果仅对受试奶牛场的病原流行病学、耐药性调查和药物选择具有指导性，并不具有广泛的通用性和代表性。山西省内更大范围的奶牛乳房炎流行状况及其病原菌金黄色葡萄球菌的耐药情况还需不断扩大病原菌的分离数量作进一步的试验调查。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Survey of Staphylococcus
aureus from Milk in a Dairy Farm

HANShufang，LIUYifei，WANGGuoyan，WANGZhiyu，MAXin，LIANGJiyu，LI Xi
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

25 milk samples were collected from a dairy farm in Shanxi province,meanwhile some procedures such as isolation and cultivation of bacteria,staining and observation,H2O2enzyme test,and analysis of drug resistance to9 drugs were conducted respectively. A total of 18 S.aureus strains were identified successfully from 25 suspected colonies.The result showed that 18 S.aureus strains presented multidrug resistance strains.Resistance rate of all S.aureus strains to amoxicillin was the highest,up to 77.8%.Resistance rates were 11.1%-44.4%,to kanamycin,gentamicin,amikacin,ciprofloxacin,ofloxacin,fosfomycin and cefoxitin.Resistance rate of levofloxacin was the lowest,only 5.6%.The result indicated that S.aureus strains were the pathogenic bacteria of bovine mastitis in the dairy farm,and produced drug resistance to 9 drugs.Treatment should be carried based on the drug sensitivity test to selecte more sensitive drugs.

milk;Staphylococcus aureus;isolation and and identification;drug resistance

S858.23

A

1002-2481（2016）11-1696-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.28

2016-06-16

山西省农业科学院攻关项目（YGG1427）

韩淑芳（1979-），女，山西左云人，助理研究员，主要从事畜禽养殖技术研究工作。刘一飞为通信作者。