水稻茉莉酸响应基因的分析

季科研，樊凌志，Bella akoa gilles marius，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

水稻茉莉酸响应基因的分析

季科研，樊凌志，Bella akoa gilles marius，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

茉莉酸是植物体内天然的调节剂，在植物生长发育过程及响应外界环境胁迫方面具有重要的作用。为了分析水稻中茉莉酸的响应基因，设计了OsPDF1.2，OsVSP2，OsJAZ8的定量PCR引物，利用100 μmol/L茉莉酸和100 μmol/L菲尼酮（内源茉莉酸合成抑制剂）处理的叶片为材料，分析了OsJAZ8，OsPDF1.2，OsVSP2等3个基因对茉莉酸的响应情况。结果表明，OsJAZ8，OsPDF1.2随着茉莉酸处理时间的延长，表达量逐渐升高，随着菲尼酮处理时间的延长，表达量逐渐降低，而OsVSP2则与之相反；OsJAZ8对于茉莉酸的响应较OsPDF1.2，OsVSP2这2个基因更加敏感。据此结果认为，OsJAZ8的表达量可以作为水稻叶片中茉莉酸相对含量的指标。

茉莉酸；水稻；RT-PCR；相对转录水平

水稻（Oryza sativa L）是世界上最重要的粮食作物，世界上超过90%的水稻集中种植在亚洲，供给了地球上60%人们的粮食需求。高盐、干旱和碱性环境，包括高浓度的Na+、过高的pH值、高浓度的CO32-和HCO3-等，是抑制植物生长与发育的主要环境压力，其中，高盐影响了20%的灌溉农业用地[1]，导致农作物产量严重损失，每年造成永久性亏损150万hm2，因此，科学家一直将提高植物的抗性作为重要的研究方向。在各种环境压力下，植物已进化出不同的机制来感应、应对各种环境压力[2-4]。

茉莉酸（jasmonic acid，JA）及其甲酯是天然的植物生长调节剂。从1962年发现茉莉酸至今，人们对茉莉酸的合成途径已经较为清楚。当植物受到胁迫时，亚麻酸从叶绿体膜释放后经脂氧合酶途径氧化为13（S）-氢过氧-亚麻酸，再在丙二烯氧化合成酶和丙二烯氧化环化酶的作用下生成12-氧-植物二烯酸（OPDA），然后离开叶绿体进入过氧化物酶体形成茉莉酸，最后代谢为茉莉酸甲酯（JAMe）、茉莉酸氨基酸结合物等衍生物[5]。JA调节水稻的生长发育（如发芽、茎的伸长、根的生长、开花、衰老等），参与对环境胁迫的响应（光形态建成、向地性、非生物胁迫的适应等），参与生物胁迫（微生物、线虫以及食草动物等）的防御反应[6]。内源JA的测定方法主要是LC-MS，RT-PCR等。Spoel等[7-8]分别利用JA响应基因PDF1.2与VSP2分析了拟南芥JA的相对含量。OsJAZ8是水稻茉莉酸结构域蛋白，参与了水稻内源茉莉酸响应过程，Yamada等[9]研究发现，其表达与JA呈明显的正相关性。目前，利用水稻响应基因分析JA的相对含量尚未见报道。

本研究以水稻日本晴为研究材料，以拟南芥茉莉酸响应基因PDF1.2和VSP2的水稻同源基因以及水稻OsJAZ8为目标，探讨外源茉莉酸、内源茉莉酸合成抑制剂——菲尼酮[10]处理对OsPDF1.2，Os－VSP2，OsJAZ8表达的影响，分析茉莉酸与这3个基因表达的相关性。

1 材料和方法

1.1 植物材料和生长条件

供试材料为水稻日本晴种子。种子经10%（V/V）次氯酸钠表面消毒30 min，无菌蒸馏水漂洗5次后，于37℃发芽。取露白种子置于96孔板中，在光照培养箱中水培（昼/夜温度为28℃/26℃，光照14/10 h）。三叶期后，用3.3 mmol/L硫酸盐的半培养液（全培养液∶水＝1∶1）培养7 d，之后用3.3 mmol/L全培养液培养7 d，在培养期间增添被蒸发和吸收的水。

1.2 JA响应基因的筛选和引物设计

根据拟南芥 VSP2和 PDF1.2序列，利用BLAST同源比对（www.ncbi.nlm.nih.gov）获得水稻粳稻的OsPDF1.2，OsVSP2序列。经oligo（dT）primers软件设计OsPDF1.2，OsVSP2，OsJAZ8的引物，利用溶解曲线峰检测引物特异性，从而筛选出特异性引物（表1）。

表1 RT-PCR以及半定量PCR引物

1.3 RNA提取和cDNA合成

21 d幼苗经外源茉莉酸（100 μmol/L）以及菲尼酮（100 μmol/L）处理不同时间后，取叶片0.5 g置于液氮中充分研磨至粉末，经Trizol法[9]提取RNA，并存放于-80℃中保存。

逆转录反应体系20 μL为：RNA放入65℃热变性5 min后，立即置于冰上冷却，并分别加入RNA1 μg，5×RTBuffer 4 μL，RTEnzyme Mix1 μL， primerMix1μL，用Nuclease-freewater定容至20 μL（浓度50 ng/μL），水浴37℃15 min，98℃5 min，反应结束后存放于-20℃。

1.4 实时定量RT-PCR和半定量分析

定量RT-PCR（ABI 7500）采用20 μL反应体系：10 μL 2×SYBR Green RT-PCR Master Mix（Toyobo），引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，50× ROX0.4 μL，加入ddH2O定容至20 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，40个循环。

以水稻基因作为内参，并采用2-ΔΔCt法进行定量分析。半定量PCR设3次重复，条件相同，采用20μL反应体系，30个循环，反应扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后，PCR产物采用2%TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 蛋白质同源性分析

通过蛋白质中氨基酸序列对比可知，拟南芥中JA响应基因PDF1.2和VSP2与水稻同源类似物（NM_001185895.1，NM_001063282.1）的氨基酸序列相似度分别为43%和33%。

2.2 OsPDF1.2转录表达分析

经过外源茉莉酸（100 μmol/L）以及菲尼酮（100 μmol/L）分别处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsPDF1.2的转录水平，结果表明，随着茉莉酸处理时间的延长，其相对转录量增多（图1-A），处理24 h后其相对转录量是对照的1.8倍，而菲尼酮处理可降低其转录量（图1-B）。半定量RT-PCR的结果同样表明，茉莉酸和菲尼酮处理分别可以促进和降低OsPDF1.2的转录表达（图2）。

2.3 OsVSP2转录表达分析

经过外源茉莉酸（100 μmol/L）以及菲尼酮（100 μmol/L）分别处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsVSP2的转录水平，结果表明，随着茉莉酸处理时间的延长，其相对转录量下降（图3-A），与OsPDF1.2相反，当处理24 h后其相对转录量是对照的0.05倍，而菲尼酮处理却增加其转录量（图3-B）。半定量RT-PCR的结果同样表明，茉莉酸和菲尼酮分别可以降低和促进OsVSP2的转录表达（图4）。

2.4 OsJAZ8转录表达分析

经过外源茉莉酸（100 μmol/L）以及菲尼酮（100 μmol/L）分别处理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻叶片中OsJAZ8的转录水平，结果表明，随茉莉酸处理时间延长，其相对转录量增加（图5-A），与OsPDF1.2相同，但与OsVSP2却相反，处理24 h后其相对转录量是对照的13倍，而菲尼酮处理却降低其转录量（图5-B）。半定量RT-PCR的结果同样表明，茉莉酸和菲尼酮分别可以促进和降低OsJAZ8的转录表达（图6）。

3 讨论

植物体内激素是植物生命活动的主要承担者，当外界生物环境发生变化，其体内激素也会产生相应的变化，以调节自身的生长发育。近年来，植物生长调节剂被认为在改善植物逆境受损方面具有一定的作用，可以提高作物的产量和质量[11-12]。茉莉酸（JA）及其茉莉酸甲酯，是天然存在的植物生长调节剂，调节植物的形态建成及生理生化代谢过程[12-13]。许多研究表明，茉莉酸在非生物环境压力下，对植物起到了保护的作用[14]。茉莉酸（JA）及茉莉酸甲酯（MeJA）广泛存在于植物体内，与抗性关系密切相关，能够显著增强植物在机械伤害、低温、盐害、干旱等非生物环境胁迫和病虫害等生物胁迫中的抗性[15]。

拟南芥的茉莉酸响应基因OsPDF1.2和OsVSP2序列与水稻蛋白序列的相似性分别达到43%，33%。为了分析水稻的茉莉酸响应基因，本研究选择了OsPDF1.2，OsVSP2，OsJAZ8为目标基因，分析了茉莉酸及其生物合成抑制剂对其表达的影响，结果表明，经100 μmol/L外源茉莉酸处理，可以提高水稻叶片中OsPDF1.2，OsJAZ8的表达，而降低了OsVSP2的表达；经100 μmol/L的菲尼酮处理，降低了OsPDF1.2，OsJAZ8的表达，提高了OsVSP2的表达。经24h的茉莉酸处理，OsPDF1.2，OsJAZ8的表达分别是对照的2.8倍和14倍，而OsVSP2降低至对照的5%。此结果表明，OsPDF1.2，OsJAZ8是水稻茉莉酸的正相关基因，而OsVSP2是茉莉酸的负相关基因，且OsJAZ8对于茉莉酸的敏感性较OsPDF1.2，OsVSP2更加敏感。半定量RT-PCR结果及相对亮度计算也得到了一致的结果。

OsJAZ8与OsPDF1.2对茉莉酸的转录表达响应，与拟南芥同源蛋白的表达调控是一致的[9，16]。Spoel等[16]研究发现，拟南芥VSP表达量随着外施茉莉酸处理时间的增加而升高，是茉莉酸的正响应基因，与拟南芥AtVSP2的转录调控相反，本研究结果表明，水稻OsVSP2是茉莉酸的负调控基因，但引起此差异的机理尚不清楚。此结果也表明，不同植物同源基因的表达调控未必一致。

茉莉酸作为植物激素在植物体内发挥着重要的作用，参与调控了植物的生长发育以及抗生物及非生物胁迫的过程。本研究以OsJAZ8，OsPDF1.2，OsVSP2为目标基因，分析了其对茉莉酸的响应及敏感程度，结果发现，OsJAZ8是茉莉酸的正相关基因且较为敏感，推测可以利用OsJAZ8的相对表达量来反映水稻内源茉莉酸的相对含量。

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Analysis of Jasmonic Acid Response Gene in Rice

JI Ke-yan，FAN Ling-zhi，Bella akoa gilles marius，PU Shou-cheng，SUN Mei-hao
（College of Chemistry＆Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Jasmonic acid,one of the plant hormones,plays vital roles in plant developments and dealing with biotic and abiotic stresses.To analyze rice marker genes for jasmonic acid,three genes（OsPDF1.2,OsVSP2,OsJAZ8）were selected,and their relative transcription levels were studies by quantitative PCR（qPCR）and semi-quantitative RT-PCR（sqRT-PCR）,using rice leaves treated with jasmonic acid or its biosynthesis inhibitor,phenidone as materials.The results of qPCR demonstrated that transcription of OsJAZ8 and OsPDF1.2 were upregulated by jasmonic acid,while they were both downregulated by phenidone.On the contrary,the transcription of OsVSP2 was downregulated by jasmonic acid,and upregulated by phenidone.Transcription of OsJAZ8 was also found more sensitive than OsPDF1.2 and OsVSP2 to jasmonic acid signal.According to the results,the relative transcription levels of OsJAZ8 could be used to indicate relative content of jasmonic acid in rice leaves.

jasmonic acid;rice;RT-PCR;relative transcription levels

S511

A

1002-2481（2016）05-0587-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.05

2016-01-26

国家自然科学基金项目（31070055）；浙江省本科院校中青年学科带头人学术攀登项目（pd2013060）

季科研（1990-），男，安徽宿州人，在读硕士，研究方向：蛋白质结构与功能。孙梅好为通信作者。