大豆细胞质雄性不育恢复基因的标记定位

连世超，雷梦林，张瑞军，白志元，张海平，卫保国

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031）

大豆细胞质雄性不育恢复基因的标记定位

连世超1，雷梦林2，张瑞军2，白志元2，张海平2，卫保国2

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031）

利用三系法生产大豆杂交种能够有效提高大豆产量。为挖掘大豆三系育性恢复基因，利用大豆细胞质雄性不育系SXCMS1A与恢复系AHH-8构建F2育性分离群体，开展不育系育性遗传分析及育性恢复基因初定位研究。结果表明，F1群体花粉镜检为半不育，成熟期植株结实正常；F2群体花粉镜检可育株与半不育株的分离比为1∶1，成熟期植株结实正常无不育株，从而推测该大豆细胞质雄性不育系为单基因配子体不育。利用SSR标记对F2群体进行分析，获得了位于D1a连锁群上的2个与恢复基因紧密连锁的标记Satt184和Satt267，遗传距离分别为17.3，10.2 cM。因此，将恢复基因定位于D1a连锁群上，可为下一步精确定位恢复基因奠定基础。

大豆；细胞质雄性不育；恢复基因；SSR标记

杂种优势利用是提高作物单产的重要途径之一[1]，在水稻、玉米、高粱、油菜等作物中已被广泛应用。随着大豆细胞质雄性不育三系配套技术的完成，利用大豆三系生产杂交种已步入应用阶段[2-4]。大豆细胞质雄性不育的遗传特点和基因定位的研究将有助于深入了解大豆细胞质雄性不育的遗传机制，为精确定位该基因和进一步克隆基因奠定基础。

近年来，随着分子标记技术的应用，国内外研究者已对不同作物的细胞质雄性不育恢复基因进行定位研究[5-8]。在大豆细胞质雄性不育恢复基因的定位研究中，赵丽梅等[9]利用YA×167的F2分离群体及YA×（YB×167）群体在J连锁群上获得了与恢复基因连锁的2个标记Satt414，Satt596，与恢复基因的距离分别为16.4，14.6 cM。任良真[10]利用组合JLCMS9A×JLR2的F2分离群体，将恢复基因同样定位在J连锁群上，获得了3个连锁标记JS22，JS30，JS51，遗传距离分别为7.6，10.7，5.2 cM。Yang等[11]将NJCMS1A的2个恢复基因分别定位在M和A1连锁群上。另外，Dong等[12-15]利用不同材料分别将恢复基因定位于J，D2，A，O连锁群上。可见，材料、群体、方法不同，其结果也存在差异，反映了大豆现有细胞质雄性不育性的遗传基础比较复杂。因此，本研究针对山西当地优良恢复系的恢复基因进行标记定位仍然具有区域代表性。

近30 a，山西省农业科学院农作物品种资源研究所大豆课题组致力于大豆杂种优势利用研究与应用，从大量的杂交组合和多年多点的试验中筛选出一批优良的恢复系材料，其恢复率表现稳定。本研究利用分子标记辅助选择筛选与恢复基因紧密连锁的SSR标记，不仅可将恢复基因定位到具体的染色体上，为进一步克隆该恢复基因奠定基础，同时在选配强优势组合过程中可提高亲本选择的效率。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料大豆细胞质雄性不育系SXCMS1A及恢复系AHH-8由山西省农业科学院农作物品种资源研究所大豆课题组提供。SXCMS1A由中19与JD24连续回交5代获得。以SXCMS1A为母本、AHH-8为父本构建F1，F2群体，所有材料于2012—2014年在山西省农业科学院农作物品种资源研究所榆次东阳大豆试验基地网室内严密隔离种植。

1.2 大豆花粉育性鉴定

在大豆盛花期，采摘每株中上部当天即将开放的花蕾3朵，用70%酒精固定后，取出花药用1% I2－KI染色，在高倍（40×）光学显微镜下进行镜检，观察花粉育性，随机选取3个视野，分别统计不育和可育花粉粒的数目，计算花粉败育率。参考赵丽梅等[16]提出的大豆花粉育性判定为标准可育、半不育、不育花粉的败育率分别为0～10%，10.1%～90%，90.1%～100%，来鉴定植株育性。成熟期可育植株表现为能够正常成熟，具有大量黄色结实荚，无无性荚果，叶片完全脱落；不育株表现为整株呈浓绿色，叶片肥厚不脱落，茎秆粗壮，结有大量未受精的幼嫩无性荚果。结合盛花期镜检结果将植株进行育性分类。采用χ2适合性测验检测鉴定结果。

1.3 DNA提取

在大豆三节（V3）期，从母本SXCMS1A、父本AHH-8及二者杂交后代F1，F2群体植株上分单株摘取叶片，-80℃保存。采用CTAB[17]法提取叶片DNA，并检测其浓度和质量。

1.4 基因池的构建

利用混合分组分析法[18]（bulked segregate analysis，BSA），结合花粉鉴定结果，从F2群体中随机选取10株可育单株的等量DNA混合构成可育基因池；随机选取10株半不育单株的等量DNA混合构成半不育基因池；随机选取10株不育系单株的等量DNA混合构成不育基因池。

1.5 SSR标记分析

在Soy Base网站（http://soybase.org/）上挑选445对均匀分布在大豆20个连锁群上的SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR体系10 μL：0.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL Primer（10 μmol/L），1 μL 10×PCR buffer，0.1 μL Taq Polymerase（5 U/μL），5 μL模板DNA（10 ng/μL），1.4 μLddH2O。PCR反应条件为：94℃5 min；94℃1 min，退火温度退火30 s，72℃30 s，34个循环；72℃10 min；4℃保存。PCR仪为BIO-RADC1000 Thermal Cycler。每对SSR引物具有特定的退火温度，根据实际Tm值设定引物适合的退火温度，其他程序不变。扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、拍照记录试验结果。

1.6 PCR数据处理与分析

根据PCR扩增产物电泳带型，与不育基因池带型一致记录为a，与半不育带型一致记录为h，与可育基因池带型一致记为b，将统计结果记录在Excel表中。采用作图软件Join Map 4.0分析标记与恢复基因之间的连锁关系，构建分子遗传图谱，并计算遗传距离。

2 结果与分析

2.1 大豆细胞质雄性不育的遗传规律

2013年母本不育系SXCMS1A经镜检，花粉平均败育率为97.44%，成熟期植株表现全部不育。父本恢复系AHH-8花粉平均可育率为98.11%，成熟期植株表现全部可育。组合SXCMS1A×AHH-8的F1群体共有306株，花粉平均败育率为53.28%，成熟期植株全部正常结实，无不育株。2014年组合SXCMS1A×AHH-8的F2植株共有293株，花粉镜检可育、半不育植株数目分别为139，154株。经χ2适合性测验检测符合可育∶半不育为1∶1（χ2＝0.77，P＝0.38＞0.05，表1），因此，推测该大豆细胞质雄性不育为单基因配子体不育。其遗传模式为：不育系SXCMS1A S（rfrf）与恢复系AHH-8 N（RfRf）杂交形成F1S（Rfrf），由于雄配子（rf）不育不能正常传递给下一代，F2只能出现S（Rfrf），S（RfRf）2种类型，且比例为1∶1。

表1 F2群体育性分离的适合性测验

2.2 大豆细胞质雄性不育恢复基因定位

利用可育基因池、不育基因池和半不育基因池对分布于20条连锁群上的445对SSR引物进行多态性筛选，结果发现，位于D1a连锁群上的标记Satt184，Satt267扩增产物表现特异的多态性。标记Satt184，Satt267均在可育基因池和不育基因池中分别扩增出一条与可育亲本和不育亲本带型一致的特异带。因此，将恢复基因定位于D1a连锁群上。用引物Satt184，Satt267对F2群体进行单株验证，结果除部分单株发生交换外（其中，引物Satt267在可育植株中11，14号和18号单株发生交换，在半不育植株中26，33，40号和41号单株发生了交换），可育植株扩增的带型同可育基因池扩增的带型一致（图1，2，3）。

2.3 遗传作图分析

根据F2群体293个单株对应的2个引物扩增结果，用Join Map 4.0软件对2个标记和1个恢复基因（暂命为Rf）进行遗传作图分析，结果表明，恢复基因Rf与标记Satt184，Satt267的遗传距离分别为17.3，10.2 cM（图4）。

3 讨论

本研究从亲本材料的选择上，对SXCMS1A和AHH-8的花粉染色、成熟期结实率等表型进行鉴定，SXCMS1A雄性不育性状和AHH-8可育性状的稳定性可达到100%，同时细胞质雄性不育可稳定遗传，其育性受核、质基因共同控制，因此，配制组合SXCMS1A×AHH-8对其细胞质雄性不育遗传规律的探索完全可行。赵丽梅等[9]、任良真[10]、Dong等[12]和汤复跃等[14]分别用不同材料对细胞质雄性不育系育性恢复遗传模式进行研究，结果表明，这些细胞质雄性不育系材料的育性恢复遗传符合单基因配子体不育。本研究中，F1植株花粉败育率为53.28%，为半不育，初步推断，该细胞质雄性不育系为单基因配子体不育或孢子体不育的不完全显性。因此，F2理论上可能出现2种情况：单基因配子体不育的一个显著特点是不育基因不能通过雄配子传递，在F2群体中花粉分离比例为可育∶半不育＝1∶1；孢子体不完全显性的F2分离比例为可育∶半不育∶不育＝1∶2∶1。实际检测到F2群体（293株）可育与半不育植株数分别为139，154株。经χ2适合性测验检测符合可育∶半不育＝1∶1（χ2＝0.77，P＝0.38＞0.05），因此，推测该大豆细胞质雄性不育属单基因配子体不育，这与赵丽梅等[9]、任良真[10]、Dong等[12]和汤复跃等[14]的研究结果一致。由此推测，以上研究中的细胞质雄性不育系的不育和恢复机理可能是相同的。

运用SSR分子标记技术来定位恢复基因已成为当前研究大豆细胞雄性不育恢复基因的重要方法之一。SSR标记具有稳定性好、重复性高、费用低廉和共显性等优点[19-22]。赵丽梅等[9-15]分别将不同的恢复基因定位在J，J，（M，A1），J，D2，A1，O连锁群上。本研究以组合SXCMS1A×AHH-8的F2群体为定位群体，利用445对大豆SSR引物对大豆细胞质雄性不育的恢复基因进行定位，发现标记Satt184，Satt267与恢复基因紧密连锁，可将恢复基因定位在D1a连锁群上，这与前人的定位结果不同。一方面，可能由于父本材料自身核遗传背景存在差异，从而形成不同的育性恢复基因；另一方面，大豆细胞质雄性不育系的育性遗传比较复杂，除了受自身基因控制以外，还容易受到周围环境的影响。不同的生理环境可能会造成花粉育性变化上的差异，最终导致恢复基因定位结果的不同。以上推测还需要进一步的试验加以验证。

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Marker Location for Cytoplasmic Male Sterile Restorer Gene in Soybean

LIAN Shi-chao1，LEI Meng-lin2，ZHANG Rui-jun2，BAI Zhi-yuan2，ZHANG Hai-ping2，WEI Bao-guo2
（1.College of Biological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops，Institute of Crop Germplasm Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Utilization of the cytoplasmic male sterile（CMS）line SXCMS1A×AHH-8 constructed F2segregation population, cytoplasmic male sterility restorer gene was located using SSR markers in soybean.The results showed that the F1pollen was semi sterile, but the plants were normal.The separation ratio of fertile plants and semi sterile plants of F2was 1∶1,which was under χ2test.So as to speculate,the soybean cytoplasmic male sterile gene belonged to single-gene gametophyte sterile.445 pairs SSR primers of soybean were chosen to screen the F2segregation population.The restorer gene was located at D1a linkage group.The genetic distances of Satt184 and Satt267 were 17.3,10.2 cM,respectively.The research laid the foundation for further location of restorer gene.

soybean;cytoplasmic male sterile;restorer gene;SSR marker

S565.1

A

1002-2481（2016）05-0579-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.03

2016-01-05

科技部“863”计划项目（2011AA10A105）；山西省青年科技研究基金项目（2014021029-1）

连世超（1987-），男，山西高平人，在读硕士，研究方向：作物杂种优势利用。卫保国为通信作者。