猪O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰，陈文娟，李建军，吕传忠，任东兴，陈 庚，付旭彬*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300308）

猪O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰1，陈文娟1，李建军1，吕传忠2，任东兴2，陈 庚2，付旭彬2*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300308）

为了解猪O型口蹄疫合成肽疫苗免疫28 d后是否能够增强对易感仔猪的免疫效力，本研究将猪O型口蹄疫合成肽抗原乳化后按1头份、1/3头份和1/9头份三组剂量分别免疫易感仔猪。在免疫第28 d检测仔猪血清中的中和抗体滴度及攻毒保护试验检测PD50。结果显示：1头份剂量组VP1抗体滴度最高达1:45，且显著高于其他剂量组VP1抗体滴度（P<0.05）；1/3头份剂量组VP1抗体滴度最高达1:22，1/9头份剂量组VP1抗体滴度均为1:16，该两组间无显著差异（P>0.05）。猪O型口蹄疫合成肽疫苗能够有效抵抗O/GX/09-7毒株和JMS毒株的侵袭，增强了易感仔猪对该两种病毒的免疫保护力。

口蹄疫病毒；Th表位肽；疫苗免疫增强剂；合成肽疫苗；抗体滴度；攻毒保护

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）是一类小型RNA病毒，被定义为口蹄疫病毒属。一经发现口蹄疫疫情，按法律规定必须上报世界动物卫生组织（OIE）[1]，它给畜牧产业造成巨大损失。免疫注射口蹄疫疫苗是公认有效的预防口蹄疫病毒的方法之一，临床上主要使用全病毒灭活疫苗和合成肽疫苗对易感动物进行防治。合成肽疫苗存在无须操作全病毒，安全性高，稳定性好，生产工艺简单等优点[2]，被人们认为是一种安全、可靠的防治口蹄疫疫病的疫苗。然而，口蹄疫合成肽疫苗的免疫剂量、免疫效力以及有效保护率仍需通过相关试验进一步确定。

自1982年有学者提出一种新型口蹄疫疫苗[3]，即合成肽疫苗，FMDV的表位蛋白研究不断深入，对于疫苗的免疫效力检测方法也不断更新。倪卫忠等[4]对包括免疫球蛋白IgG、IgM等和免疫后VP1抗体滴度的检测评价了口蹄疫病毒的免疫应答成效。还有研究人员[5]通过血清细胞因子IFN-γ、CD8+T淋巴细胞、三种VP1的表达水平分别对比了两种口蹄疫病毒合成肽疫苗的免疫效力。大量研究表明，口蹄疫合成肽疫苗对于口蹄疫的防治起到一定成效。至2014年，农业部正式批准了一类合成肽疫苗成为新兽药[6]。本试验通过检测O型口蹄疫合成肽疫苗的VP1抗体滴度及PD50，期望能为提升疫苗安全性，确保疫苗稳定性，明确疫苗最佳免疫量提供一些参考。

1 材料与方法

1.1试验动物及分组30只体重为40 kg左右的易感仔猪（FMDV中和抗体效价不高于1:8或ELISA抗体效价不高于1:8）。该批仔猪购自云南省饲养散户于云南省生物制品研制中心基地圈养，随机分成A、B、C三组，每组10只，并用耳标编号。

1.2检验用毒株口蹄疫O型病毒（O/GX/09-7株）、口蹄疫O型病毒（JMS株）由云南省生物制品研制中心提供，攻毒试验于云南省生物制品研制中心P3实验室进行。

1.3主要试验试剂和仪器猪O型口蹄疫合成肽抗原由瑞普生物技术股份有限公司提供；MONTANIDE ISA 61VG佐剂（批号：T30311)，购自赛彼科（上海）特殊化学品有限公司；猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白酶联免疫诊断试剂盒（批号：2014092301），购自上海优耐特生物医药有限公司；酶标检测仪（Bio-RAD15146型），购自美国伯乐公司。

1.4试验方法

1.4.1 动物免疫 将乳化后的猪O型口蹄疫合成肽抗原分别耳后根肌肉注射仔猪，根据中华人民共和国兽药典半数保护量测定法通则分为：A组为1头份剂量组（1.0 mL），B组为1/3头份剂量组（0.33 mL），C组为1/9头份剂量组（0.11 mL），免疫28 d后收集血清并攻毒[7]。

1.4.2 间接ELISA检测血清VP1抗体 操作步骤严格按照上海优耐特猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白酶联免疫诊断试剂盒说明书进行。

1.4.3 PD50检测 接种后28 d，将每个剂量组分为两小组，5头/组进行攻毒试验，其中一组每头猪耳根后肌肉注射2 mL毒价为103TCID50的/O/GX/09-7株乳鼠毒；另一组每头猪耳根后肌肉注射2 mL毒价为103TCID50的JMS株乳鼠毒。连续观察10 d。对照猪均应至少有一蹄出现水泡或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。出现发病猪后要及时进行隔离。根据免疫猪的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。即l g PD50=l g（高于50%剂量组）+距离比例 ×l g（高于50%剂量组）[8]。

1.5统计学分析本试验所有试验数据均使用SPSS 17.0进行分析，统一表示为平均值±标准差（X±SE），采用独立样本t检验比较组间差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1血清VVPP11抗体检测结果采用间接ELISA方法检测免疫仔猪28 d后的血清VP1抗体效价。结果显示，1头份剂量组VP1抗体滴度最高达1:45；1/3头份剂量组VP1抗体滴度最高达1:22；1/9头份剂量组VP1抗体滴度均为1:16，且1头份剂量组VP1抗体滴度显著高于1/3头份剂量组和1/9头份剂量组（P＜0.05），详见表1。

2.2PPDD5500检测结果每个剂量组分两组分别耳后肌肉注射2 mL O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒，连续观察10 d后，试验结果显示：攻O/GX/09-7株乳鼠毒的，1头份剂量组保护率达4/5，1/3头份剂量组保护率达5/5，1/9头份剂量组保护率达2/5；攻MS株乳鼠毒的，1头份剂量组保护率达5/5，1/3头份剂量组保护率达5/5，1/9头份剂量组保护率达5/ 5。攻O/GX/09-7株乳鼠毒后，PD50为10-0.8112头份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接种0.155头份便可以使50%易感仔猪获得保护，每头份疫苗含6.45 PD50；攻JMS株乳鼠毒后，O型口蹄疫合成肽疫苗PD50为10-1.19头份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接种0.064头份便可以使50%易感仔猪获得保护，每头份疫苗含15.59PD50，详见表2。

表1 免疫仔猪血清抗体滴度Table1 Antibody of piglets in its serum after immunity

表2 仔猪免疫后攻毒PD50情况Table2 PD50of piglets after toxicity attack

3 讨论

我国与世界动物卫生组织评价疫苗效力最直接数据是病毒中和抗体检测和动物免疫保护力检测[9]。本研究通过间接酶联免疫吸附试验对免疫猪O型口蹄疫合成肽疫苗的仔猪血清进行口蹄疫VP1抗体滴度检测以及免疫后28 d攻毒试验检测PD50，评价了本试验使用的猪O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力。免疫28 d后，猪O型口蹄疫合成肽疫苗能够显著增加仔猪血清中VP1抗体滴度。通过对免疫了猪O型口蹄疫合成肽疫苗的仔猪进行PD50检测试验显示，本试验所用猪O型口蹄疫合成肽疫苗对两种毒株的免疫效力均大于6，且攻毒保护率结果理想，效力稳定。其中，猪O型口蹄疫合成肽疫苗对JMS毒株的抵抗力尤为显著。猪O型口蹄疫合成肽疫苗成功出世对口蹄疫疫苗的发展起到了很大的推动作用，研究人员在新型口蹄疫防治方法的安全性、免疫效力和经济成本方面也取得进步。赵利平等[10]通过对O型基因工程疫苗的免疫保护试验进行研究，得到该疫苗大于3的免疫效力，且为基因工程疫苗的大规模产业化生产奠定研究基础。

本试验中合成肽疫苗的免疫效力大于6，在免疫保护率方面表现了比基因工程苗更好的优越性，但合成肽疫苗的稳定性仍需大量试验数据支持，离大规模产业化生产仍存在一些问题亟需解决。王继华等[11]对现有O型口蹄疫灭活苗进行超滤浓缩后免疫，最终进行攻毒保护试验，认为浓缩抗原后可显著提升牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型二价灭活疫苗免疫效果。而本试验中的口蹄疫病毒合成肽系病毒表面的两段主要氨基酸序列，结果中出现1头份免疫剂量保护率小于1/3头份免疫剂量保护率现象，分析可能与合成肽疫苗免疫最佳剂量并非越高越好有关，如若想达到更好的免疫效果和更高的PD50，建议尝试抗原合成肽的浓缩纯化等方式，其对野毒产生免疫保护的抗原量有待进一步研究。

4 小结

该试验从兽药典公认的抗体水平和动物免疫保护力方面证明瑞普生物技术股份有限公司提供的猪O型口蹄疫合成肽疫苗对O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒有一定的抵抗作用，能够保护易感仔猪免受该两种毒株侵袭，为口蹄疫疫苗的最佳免疫剂量提供参考。

[1]MASON P W,GRUBMAN M J,BAXT B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J]. Virus Research,2003,91(1):9-32.

[2]冯俊吾，潘志荣.口蹄疫流行现状的分析及防控措施[J].养殖技术，2008（3）：100-101.

[3]张伯澄.一种新型的口蹄疫疫苗——合成肽疫苗[J].兽医科技杂志，1983.

[4]倪卫忠，孙泉云.动物对口蹄疫病毒的免疫应答及口蹄疫疫苗的质量评估[J].现代农业科技，2008（16）：273-274.

[5]Feng Shan Gao,Lei Feng,Qiang Zhang,et al. Immunogenicity of Two FMDV Nonameric Peptides Encapsulated in Liposomes in Mice and the Protective Efficacy in Guinea Pigs[J]. Plos One,2013,8(7)：1-9.

[6]刊辑.农业部批准两种猪口蹄疫O型合成肽疫苗产品[J].中国猪业，2014（7）：67.

[7]尹成杰.中国兽药典[S].第三版.北京：中国农业出版社.2011：附录7.

[8]郎洪武，王乐元，王家福，等.猪口蹄疫O型灭活疫苗PD50效检攻毒剂量试验[J].中国兽药杂志，2004，38（12）：9-10.

[9]李乐，信爱国，廖得芳，等.中和抗体滴度检测口蹄疫疫苗效果的研究[J].中国预防兽医学报，2009，31（3）：231-235.

[10]赵利平，刘玉梅，刘国英，等.猪口蹄疫O型基因工程疫苗免疫保护试验[J].畜牧与饲料科学，2013，34（2）：8-9.

[11]王继华，邵明，施程洪，等.抗原浓缩纯化工艺对口蹄疫灭活疫苗免疫效果评价[J].中国兽医学报，2011，31（5）：684-686.

Research on the immune effection of Type-O Foot and Mouth Disease Synthetic Peptide Vaccine

Wei Bing1,Chen Wenjuan1,Li Jianjun1,Lv Chuanzhong2, Ren Dongxing2,Chen Geng2,Fu Xubin2*
（1.Animal Science and Animal Medicine College,Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384; 2.Tianjin Ringpu Biological Technology co.,LTD,Tianjin 300308)

In order to study the immunity enhancement when imuned type-O Foot and Mouth Disease synthetic peptide vaccines for piglets after 28 d.The antigen peptides of type O Foot and Mouth Disease was divided into 1、1/3 and 1/9 doses per piglets after its emulsified.Detect the VP1 antibody of serum and PD50immunity protective test.The results show that VP1 antibody of 1 per piglets was significantly higher than other group(P<0.05),and its higest antibody titer was 1:45; VP1 antibody of 1/3 per piglets’higest antibody titer was 1:22 and VP1 antibody of 1/9 per piglets’higest antibody titer was 1:16;there were no significant differences between the latter two groups(P>0.05).The synthetic peptide vaccines of type O FMDV can effectively resist O/GX/09-7 strains and JMS strains,.It can enhance the susceptibility of the two kinds of piglets virus immune protection.

Foot-and-mouth disease virus;The epitope peptides;Immunopotentiator;Synthetic peptide vaccine;AAntibody titer;Protective efficacy

S852.659.6

B

1672-9692(2016)05-0009-04

2016-04-20

魏冰（1990-），女，硕士，预防兽医学专业。

付旭彬（1975-），男，硕士，研究员，技术发展部总监，主要从事兽医生物技术与疫苗研究。

畜禽用合成肽新型疫苗的国际合作研究。