MEV灭活疫苗免疫后鸡蛋卵黄抗体消长规律的探究

王小柱

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

MEV灭活疫苗免疫后鸡蛋卵黄抗体消长规律的探究

王小柱

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

为了解产蛋鸡在疫苗接种后卵黄抗体浓度和效价的消长规律，本试验以商品化水貂病毒性肠炎病毒（MEV）灭活疫苗免疫成年海兰褐蛋鸡。经免疫后，采集鸡蛋样本，通过水溶法提取卵黄抗体，经硫酸铵两步沉淀，透析纯化，过滤除菌后制得纯净的卵黄抗体。结果显示，水溶法制备的卵黄抗体纯度为60%～80%，得率为60%，免疫后抗体浓度和效价迅速上升，到30 d达到峰值而后逐步下降，在120 d内二者消长规律基本一致。至150～180 d时抗体浓度下降为峰值的50%，而此时其HI效价已与阴性组相差不大。因此一免后150 d内卵黄抗体滴度有良好的保护作用。

水貂病毒性肠炎病毒；卵黄抗体；浓度；效价；消长规律

水貂病毒性肠炎（Mink enteritis）是危害毛皮动物养殖的三大疫病之一，其病原是水貂病毒性肠炎病毒（mink enteritis parvovirus，MEV）。水貂、狐狸、貉等毛皮动物普遍易感，幼兽致死率可达80%～100%[1]。20世纪80年代在我国首次发现，呈群发性流行，目前尚无特效的治疗药物，疫苗接种是有效的的预防手段。但临床上MEV的灭活疫苗只能诱发体液免疫应答，近年来人们开始寻求新的替代性免疫方案。随着生物制品技术的迅速发展，卵黄抗体技术因其价格低廉、技术简单、便于推广等优点而进入人们的视野[2]。

卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）是一类在禽类动物体内广泛存在的特异性免疫球蛋白，伴随血液循环在卵巢中富集蓄积并最终进入卵黄[3]。IgY具有良好的稳定性，可耐热、耐酸和抗酶解，在4℃条件下贮存6～7年活性仅下降5%，室温贮存6个月活性无明显下降，在-20℃条件下可长久保存。目前，在临床生产上多采用水溶法（water dilution，W.D.）提取卵黄抗体[4]。

研究证实，疫苗接种蛋鸡后可迅速产生相应卵黄抗体，但对于免疫后卵黄抗体的消长规律还不熟知[4]。本研究中，利用MEV商品化灭活疫苗免疫背景清晰的海兰褐蛋鸡，在一免后180 d内对卵黄抗体水平进行了采样监测，绘制出IgY抗体浓度和效价消长规律曲线，为MEV卵黄抗体相关生物制品的临床生产和蛋鸡制定免疫程序提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料免疫抗原：MEV商品化灭活疫苗（购自齐鲁动物保健品有限公司，生产批号：1312071）。试验动物：空白免疫背景的海兰褐115日龄蛋鸡20只。主要仪器和试剂：30%聚丙烯酰胺溶液、β巯基乙醇、考马斯亮蓝、1%猪红细胞、血凝板、UV-9200紫外分光光度计、电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 蛋鸡免疫 将20只120日龄待产空白免疫背景的海兰褐蛋鸡分为MEV疫苗免疫组、阴性对照组2组，每组10只，在封闭环境中饲养至开产。采用多点肌肉（胸肌、股内侧肌）注射的方法分别接种MEV商品灭活疫苗和生理盐水，1 mL/次，一免后进行样本采集，见表1。

表1 海兰褐蛋鸡免疫方案Table1 The immunization program of Hyline Brown hens

1.2.2 鸡蛋采集与处理 样品采集时间点分别为免疫0、7、14、21、30、60、90、120、150和180 d，做好标记，置于4℃备用。

1.2.3 卵黄抗体的提取 水溶法提取卵黄抗体具体步骤如下。

1.2.3.1 水溶法溶解IgY 用酒精棉球将蛋壳表面擦拭干净并用75%酒精喷洒消毒。在无菌条件下，打开蛋壳小心剥离蛋黄，用量筒测定蛋黄体积。按照蛋黄体积:生理盐水=1:9的比例进行稀释，在4℃条件下搅拌过夜。次日用1M盐酸调节pH至5.5～5.7，并加入少量氯仿，搅拌至乳浊状态。随后将乳浊液转入离心管，在5 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清弃沉淀。

1.2.3.2 硫酸铵两部沉淀法粗提IgY 上清缓慢加入饱和硫酸铵至50%饱和度，搅拌均匀后4℃静置2 h。在6 000 r/min条件下离心15 min，收集沉淀弃上清。用生理盐水重悬沉淀至原蛋黄体积，加入饱和硫酸铵至33%饱和度，4℃静置2 h， 5 000 r/min条件下离心10 min，收集沉淀。

1.2.3.3 IgY除盐除菌 加入适量生理盐水至完全溶解沉淀，置于透析袋中透析除盐，用萘氏试剂检测直至铵根离子（NH4+）完全除尽。将透析过的卵黄液用0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃储存备用。

1.2.4 卵黄抗体浓度检测

1.2.4.1 紫外分光光度法测定IgY含量 因制备的IgY浓度过高，故将其稀释100倍，分别测定OD260、OD280吸光度值，带入下列公式：

当OD280/OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：样本蛋白质含量（mg/mL）＝1.45OD280-0.74OD260

当OD280/OD260＞1.5时，用Lamber-Beer定律计算：样本蛋白质含量（mg/mL）=OD280/K×L=（OD280/ 6.3×1）×10 g/L

其中，K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；牛血清白蛋白E1%cm=6.3（100 mL/（cm.g））。计算出提纯IgY浓度。绘制抗体浓度变化曲线。

1.2.4.2 考马斯亮蓝结合法测定IgY浓度 将IgY样品稀释100倍，放入50 mL离心管，加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。按照如下公式计算：

蛋白质含量（mg/g）=（C·VT）/(1000 VS·WF)

其中，C：查的标准曲线值（µg）；VT：提取液总体积（mL）；WF：样品鲜重（g）；VS：测定时加样量（mL）。计算出提纯IgY浓度。

1.2.5 卵黄抗体效价测定 HA/HI试验：采用血凝（HA）方法测出该MEV病毒血凝效价为1:256；依据血凝效价配制4血凝单位（即1:56）的MEV病毒液，采用固定病毒稀释血清的方法，将IgY在血凝板上依次做2倍倍比稀释，测定血凝抑制（HI）效价。

2 结果和分析

2.1SDS--PPAAGGEE检测提取纯化的IIggYY SDS-PAGE检测结果表明，水溶法提取IgY效果良好。在变性条件下，IgY解链形成重链（67 kD）和轻链（35 kD）。Quality One凝胶定量软件分析得目的蛋白条带占泳道总蛋白在60%～80%之间。见图1。

图1 IgY SDS-PAGE电泳图提取纯化Fig.1 Extraction and purification of IgY by SDS-PAGE

2.2提取IIggYY浓度测定结果表明，紫外分光光度法和考马斯亮蓝法测得三组IgY浓度基本一致，前者比后者测量值稍高。一免后IgY浓度迅速上升，21～30 d时浓度达到顶峰，并维持高浓度至100 d，随后开始逐渐下降。至150 d时抗体浓度趋于稳定，约为峰值浓度的50%，到180 d时浓度变化不大。阴性对照组IgY水平始终保持在极低水平。见图2和图3。

2.3IgY效价测定透析后IgY溶液进行HI效价测定，结果表明，免疫后IgY HI效价迅速升高，至30 d时达到峰值，为1:256～1:512。而后开始逐步下降，120 d时，HI效价下降为1:64～1:128此时IgY HI效价仍可保持在有效保护水平（HI≥1:64）。在150 d时，HI效价迅速下降为1:4～1:16之间。180 d时与对照组已无差别。见图4。

综上，成功运用水溶法提取制备了较高浓度鸡蛋的卵黄抗体，得率在60%～80%，同时得到免疫后IgY浓度和效价的消长规律和曲线。免疫后抗体浓度和效价迅速上升，30 d到达峰值。后迅速下降，在120 d内二者消长规律基本一致。至150～180 d时抗体浓度下降为峰值的50%，而此时其HI效价已与阴性组相差不大。

图2 紫外分光光度法测定IgY浓度Fig.2 Determination of IgY concentration by UV Spectrophotometry

图3 考马斯亮蓝结合法测定IgY浓度Fig.3 Determination of IgY concentration by Kaumas blue method

图4 IgY抗体血凝抑制（HI）效价Fig.4 The HI tilter of IgY

3 讨论和结论

卵黄抗体技术最初起源于1898年Klemperer的经典免疫学试验，在1995年由Staak C.首次作为专业术语提出，在20世纪末这一技术得到迅速发展，并逐步应用于动物IgG制品的替代和抗生素的辅助治疗[5]。

目前临床大规模生产IgY产品多采用水溶法（W.D.），成本低廉而且回收率在50%左右。参照Ko K.Y.等报道的用硫酸铵沉淀法提取IgY的方法[6]，本试验中对水溶法提取IgY做了适当改进，增加了除脂时调节pH至5.4～5.7，并加入少量氯仿，4℃静置等步骤，在中速5 000 r/min离心10 min即可分离出澄清上清。pH对于IgY提取效果影响明显，只有当pH调至为5.4～5.7时，脂蛋白聚集成白色絮状物悬浮在液体上层，中低速离心后即可分离除去。而在其他pH，离心5 000～8 000 r/min时，仍呈现为乳浊状态，4℃静置过夜后亦不能分层。这可能与脂蛋白的等电点（pI 5.0～5.2）有关，这可作为除脂重要条件之一。

正常鸡的IgY分子量约为180 kD，由两条轻链和两条重链组成，SDS变性条件下分子量分别为重链60～70 kD和轻链 20～30 kD[4]。本试验中，SDS-PAGE结果与上述结论一致。

在IgY浓度上，紫外分光光度法和考马斯亮蓝结合法测得浓度结果基本一致。Larsson A等测得一免后鸡蛋中约有100 mg IgY，可作为被开发的高效生物制品试剂应用于疾病的诊断和治疗中。Patterson认为，鸡抗体动力学与哺乳动物相似[5]。通常认为IgY半衰期较IgG短，浓度变化也较快。然而也有研究表明IgY能够维持高浓度达数周之久[6]。在本试验中，IgY浓度迅速升高至波峰后，维持在较高水平达数周之久，与后者结果一致。

在IgY效价上，灭活的MEV疫苗免疫后IgY HI效价迅速上升，30 d到达峰值。后迅速下降，在120 d内HI效价与浓度二者消长规律基本一致。至150～180 d时抗体浓度下降为峰值的50%，而此时其HI效价已与阴性组相差不大。

目前，国内已经出现了治疗鸭病毒性肝炎，犬细小，水貂病毒性肠炎等疾病的IgY产品和专利[7-9]，且取得了良好的临床效果，具有广阔的市场前景和应用价值。通过对海兰褐蛋鸡接种MEV商品化灭活疫苗后IgY浓度和效价消长规律的探究，为日后毛皮动物IgY制品的研发和生产提供初步的理论依据。

[1]殷震，刘景华.动物病毒学（第二版）[M].北京：科学出版社，1997.

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[3]江馗语，赵刚.卵黄抗体及其在重大动物疫病防治与诊断中的应用进展[J].现代畜牧兽医，2013，10：50-54

[4]吴博，王爽，樊兴东，等，不同方法提取卵黄抗体效果的比较[J]，中国兽药杂志，2012，46（6）:42-45.

[5] Schade R, Hlinak A. Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects[J].ALTEX,1996,13(Suppl):5-9.

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The study of IgY variation rules after immunization with MEV inactivated vaccine

Wang Xiaozhu
(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

In order to study the variation rules of IgY concentration and titer after immunization and to provide theoretical basis of prevention of mink enteritis,adult Hyline Brown hens were immunized with mink enteritis parvovirus(MEV)commercial inactivated vaccines respectively. Egg samples were collected after the first immunization and IgY antibody was extracted by water dilution method.After ammonium sulfate precipitation in two steps,dialysis and filtration,we obtained sterile purified yolk antibody.The results showed that the purity of IgY reached 60%～80%and the yield ratio reached 60%.After immunization,the titer and concentration of IgY rose rapidly and reached the peak on 30th day.Later,the concentration and tilter of IgY decreased. During 150～180 days,the concentration decreased to half the peak,while the titer had little differences with negative control.So above all,150 days after the first immunization,the tilter of IgY could have a good protective effect.

Mink enteritis parvovirus;IgY;Concentration;Tilter;Variation rules

TQ464 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)06-0014-05

2016-05-05

王小柱（1980-），男，本科，中级畜牧师，主要研究方向：动物饲养及疾病防控，畜产品安全监督。