羊膜制品对宫腔粘连分离术后宫腔渗出液中细胞因子的影响及意义*

祝鑫瑜 段 华 王 欣 汪 沙 甘 露

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100006)

·实验研究·

羊膜制品对宫腔粘连分离术后宫腔渗出液中细胞因子的影响及意义*

祝鑫瑜①段 华**王 欣 汪 沙 甘 露

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100006)

目的 探讨羊膜制品对宫腔粘连分离术(trans-cervical resection of adhesions，TCRA)后宫腔渗出液中与粘连有关细胞因子浓度变化的影响及意义。方法选择30例因重度宫腔粘连实施TCRA，随机分为研究组15例：宫腔内放置覆盖羊膜制品的Foley’s球囊导管；对照组15例：宫腔内仅放置Foley’s球囊导管。分别于术后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、72 h和4 d、5 d、6 d、7 d经球囊导管收集宫腔渗出液，测量肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)的浓度，观察羊膜制品使用后子宫腔创面渗液量与上述细胞因子的变化。结果宫腔渗液量的变化：研究组总渗液量(30.6±18.2)ml，显著少于对照组(62.7±32.9)ml(t=-3.307，P=0.003)；研究组术后48 h渗液量达峰值，中位数5.50 ml(0.50～13.00 ml)，7 d时渗液量显著低于48 h水平(χ2=15.691，P=0.000)；对照组术后4 d渗液量达峰值，中位数11.50 ml(3.00～23.00 ml)，7 d时渗液量显著低于4 d水平(χ2=9.549，P=0.002)；研究组术后7 d渗液量中位数1.00 ml(0.00～2.00 ml)，显著少于对照组中位数6.50 ml(5.00～8.00 ml)(Z=-4.666，P=0.000)。3种粘连相关细胞因子：研究组术后48 h TNF-α达峰值浓度(279.35±29.52)ng/L，术后7 d降为(243.56±43.99)ng/L(q=3.990，P<0.05)；对照组TNF-α术后48 h达峰值浓度(309.18±35.20)ng/L，与术后7 d(285.06±38.20)ng/L无统计学差异(q=2.485，P>0.05)。研究组VEGF术后72 h达峰值浓度(629.24±101.38)ng/L，术后7 d降为(428.16±104.35)ng/L(q=6.974，P<0.05)；对照组VEGF术后24 h达峰值浓度(713.47±110.20)ng/L，术后7 d降为(564.59±119.92)ng/L(q=5.169，P<0.05)。研究组IL-1术后6 d达峰值浓度(84.41±16.31)ng/L，与术后7 d(80.62±14.77)ng/L相比无统计学差异(q=0.923，P>0.05)；对照组IL-1术后5 d达峰值浓度(101.35±19.53)ng/L，与术后7 d(89.89±13.83)ng/L相比无统计学差异(q=2.736，P>0.05)。结论使用羊膜制品能够明显减少TCRA术后宫腔渗液量和渗液时间，在一定程度上降低渗出液中TNF-α、VEGF和IL-1粘连相关细胞因子的浓度，小样本数据表明TCRA术后使用羊膜制品有助于降低再粘连形成。

羊膜； 宫腔粘连； 宫腔粘连分离术； 肿瘤坏死因子-α； 血管内皮生长因子； 白介素1； 再粘连形成

宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUA)是由于子宫内膜基底层损伤导致的月经减少、闭经、继发不孕以及胚胎停育等严重影响女性生理和生育功能的疾病。宫腔镜下宫腔粘连分离术(trans-cervical resection of adhesions, TCRA)是目前公认的IUA治疗方法[1]，但由于缺乏行之有效的术后管理措施，重度IUA术后再粘连率可达到62.5%[2]，严重影响TCRA的疗效。近年来，羊膜及其制品因调控细胞分化与功能，分泌多种生物活性因子，促进细胞生长并改善微环境，抑制炎症反应，抗基质纤维化和降低瘢痕形成以及含干细胞样细胞等特性，被应用于临床领域如眼科、皮肤科和骨科等[3]，也有个案研究将羊膜应用于TCRA术后子宫腔创面的修复[4，5]。因自制新鲜羊膜有质控、运输等诸多问题，我中心将眼科等领域应用较为广泛的瑞济生物羊膜制品用于重度IUA，宫腔镜二次探查及随访显示羊膜制品可降低IUA评分、改善月经量以及提高妊娠率[6]。本研究在前期临床研究的基础上，对比分析因重度IUA实施TCRA术后宫腔内放置羊膜制品对宫腔创面渗液量与粘连相关因子的影响，进一步探讨羊膜制品预防再粘连的机理，旨在为临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究通过我院临床研究伦理委员会批准[批文号：2013-ky-038]，所有患者术前均签署知情同意书。选择2014年1～9月在我中心行TCRA治疗的重度IUA 30例(按照1988年美国生育协会IUA评分[2]：1～4分为轻度；5～8分为中度；9～12分为重度)，按照SPSS统计学软件产生的随机数字，随机分为2组：研究组15例，TCRA术后放置表面覆盖羊膜制品的Foley球囊，对照组15例，TCRA术后仅放置Foley球囊。2组年龄、孕产次、术前IUA评分、术前刮宫与宫腔操作史均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 2组患者一般资料比较

*数据采用中位数(最小值～最大值)表示

1.2 方法

1.2.1 手术方法 ①术前晚宫颈管置入橡胶尿管软化扩张宫颈。②TCRA联合腹腔镜监护，宫腔镜采用Olympus公司F24被动式连续灌流可旋转双极电切镜，灌流液为生理盐水。③采用气管插管+静吸复合全身麻醉。④采用针状电极和环状电极配合电切分离粘连，恢复宫腔形态，术中注意保护残留的正常内膜[7]。⑤研究组将2片规格为30 mm×20 mm干燥灭菌羊膜制品[江西瑞济生物工程技术有限公司，国食药监械(准)字2013第3460502号]，复水后包裹在Foley球囊表面，置入宫腔内，沿侧孔向球囊注入生理盐水4 ml，使羊膜基底面贴附于宫腔创面，外接尿袋收集渗出液；对照组仅放置Foley球囊，外接尿袋收集渗出液。行人工周期治疗3个月。

1.2.2 宫腔渗出液采集及细胞因子浓度检测 通过Foley球囊导管引流渗出液，收集时间点为术后3、6、9、12、24、48、72 h和4、5、6、7 d。采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法进行检测，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)的ELISA试剂盒均购自北京方程生物有限公司。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 宫腔渗液量及变化规律

2.1.1 宫腔渗液量 研究组TCRA术后宫腔总渗出液量为(30.6±18.2)ml，对照组为(62.7±32.9)ml，研究组显著少于对照组(t=-3.307，P=0.003)。

2.1.2 宫腔渗液量的变化规律 研究组渗液量在TCRA术后48 h达到高峰，之后逐渐下降，术后7 d渗液量显著低于术后48 h水平(χ2=15.691，P=0.000)；对照组渗液量在术后4 d达高峰，之后也逐渐下降，术后7 d渗液量显著低于术后4 d水平(χ2=9.549，P=0.002)。研究组术后7 d渗液量中位数1.00 ml(0.00～2.00 ml)，显著少于对照组中位数6.50 ml(5.00～8.00 ml)，(Z=-4.666，P=0.000)。见表2。

2.2 宫腔渗出液中粘连相关细胞因子的浓度及不同时间的变化

2.2.1 TNF-α 研究组TNF-α在TCRA术后48 h达峰值浓度(279.35±29.52)ng/L，术后7 d降为(243.56±43.99)ng/L(q=3.990，P<0.05)。对照组术后48 h TNF-α达峰值浓度(309.18±35.20)ng/L，术后7 d降为(285.06±38.20)ng/L，两者比较差异无统计学意义(q=2.485，P>0.05)。见表3。

2.2.2 VEGF 研究组VEGF术后72 h达峰值浓度(629.24±101.38)ng/L，术后7 d降为(428.16±104.35)ng/L(q=6.974，P<0.05)。对照组VEGF术后24 h达峰值浓度(713.47±110.20)ng/L，术后7 d降为(564.59±119.92)ng/L，两者比较差异有统计学意义(q=5.169，P<0.05)。见表4。

2.2.3 IL-1 研究组术后6 d IL-1达峰值浓度(84.41±16.31)ng/L，与术后7 d(80.62±14.77)ng/L相比差异无统计学差异(q=0.923，P>0.05)。对照组术后5 d达峰值浓度(101.35±19.53)ng/L，与术后7 d(89.89±13.83)ng/L相比无统计学差异(q=2.736，P>0.05)。见表5。

表2 2组术后不同时间点渗出液量比较(n=15) ml

数据采用中位数(最小值～最大值)表示，2组同一时点比较采用Mann-WhitneyU检验，同一组内不同时点比较采用非参数Kruskal-WallisH检验

表3 2组术后不同时间点TNF-α比较 ng/L

同一组内不同时点比较采用S-N-K检验

表4 2组术后不同时间点VEGF比较 ng/L

同一组内不同时点比较采用S-N-K检验

表5 2组术后不同时间点IL-1比较 ng/L

同一组内不同时点比较采用S-N-K检验

3 讨论

3.1 TCRA术后再粘连形成的原因

TCRA是在宫腔镜直视下，切除瘢痕组织、恢复解剖学形态的子宫腔整复性手术。尽管手术操作中强调有效保护残留子宫内膜，但是对于重度IUA而言，由于子宫内膜破坏范围较广，残留内膜面积不足子宫腔面积的1/3，致使分离手术后创面“巨大”，再加上术中能源介入，高频电作用电极在分离和切除子宫腔内瘢痕组织的同时，不可避免地对正常内膜组织和子宫肌壁组织产生一定电热效应，尽管如此，高频电宫腔镜在重度IUA分离矫治手术中的作用依然十分重要[1]。不仅如此，子宫腔特殊的解剖学形态也是TCRA术后创面渗液以及其中细胞因子作用于手术创面的因素，目前已知的创面渗液中含有大量炎性因子与粘连相关因子[8]，这些细胞因子将可能激活以成纤维细胞为首的间质细胞增殖，使大量纤维蛋白原及纤维连接蛋白等物质沉积，形成纤维蛋白支架覆盖创面，致使过量细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)堆积，形成炎性肉芽组织及纤维瘢痕，致使再粘连发生。这与重度IUA实施TCRA术后再粘连率高达62.5%[2]的临床现实不谋而合。

3.2 粘连相关因子对再粘连形成的作用

与其他部位的手术创面一样，TCRA术后宫腔创面在电热作用下渗出大量的细胞因子[8]，在这些细胞因子中，IL-1、TNF-α和VEGF等在组织损伤与修复的过程中发挥重要的调控作用。适量的细胞因子可以调控ECM降解与合成的平衡，促进创面组织修复；过量的细胞因子渗出则可能导致ECM过量堆积，促进肉芽组织与纤维瘢痕形成。研究[9]证实在子宫创面的瘢痕组织与内膜中,IL-1、TNF-α和VEGF在IUA均呈高度表达。作为重要炎症介质的IL-1，与受体(IL-1R)结合可促进多种免疫分子的基因表达，并刺激单核细胞和巨噬细胞产生TNF-α，对中性粒细胞产生趋化作用[10]，共同引起局部的炎症反应。创面渗出液中TNF-α的高表达，可引起VEGF的大量释放，进而诱导成纤维细胞的聚集和增加细胞外基质的合成；不仅如此，TNF-α还通过抑制MMP-9的分泌，使ECM的合成与降解失平衡，导致ECM堆积集聚，促进纤维组织增生与瘢痕形成[11]。由此可见，TCRA术后有效抑制粘连相关因子的渗出，对于降低创面再粘连形成，提高手术疗效至关重要。

3.3 羊膜对粘连相关因子的作用

羊膜中含有大量细胞因子以及细胞因子受体，能够促进损伤修复，广泛应用于医学领域。在动物试验中，羊膜对家兔眼睑角膜损伤的修复是通过抑制角膜中TNF-ɑ和VEGF的表达来实现的[12]。羊膜组织能够抑制损伤组织中IL-1、TNF以及VEGF的表达，加速炎性细胞凋亡并减轻炎症反应之作用；与此同时，羊膜还促进角膜上皮细胞迁移和黏附，防止其细胞凋亡[13，14]。因羊膜减少粘连因子的释放、促进损伤修复等特性，现已用于治疗IUA，羊膜对TCRA术后内膜化的优势可能是改善生殖预后的原因。王欣等[6]报道将生物羊膜制品应用于重度IUA，术后宫腔镜二次探查、月经量的改善以及术后平均14.6月妊娠随访的临床研究显示，再粘连评分与月经量的增加较术前均有统计学差异(P<0.05)，妊娠率也得到提高，显示羊膜制品能有效改善内膜状态从而预防再粘连的发生。本研究使用的羊膜制品是为便于运输及贮存的冻干羊膜，它的组织形态与生物活性因子与新鲜羊膜无明显差异[15]。

本研究显示应用羊膜制品治疗IUA，宫腔总渗出液量及高峰期渗液量均明显减少，且术后7 d时可恢复至较低水平，可见，羊膜制品能够更好地贴附于宫腔创面发挥作用。球囊在宫腔内起到支撑子宫前后壁的作用，但它本身也为异物，刺激创面产生炎性因子，羊膜制品阻断橡胶球囊与创面的直接接触，发挥其抑制炎性反应、抗纤维化和抑制瘢痕的作用。Orhue等[16]认为TCRA后子宫前后壁分离至少7 d创面才可愈合，而羊膜的生物屏障作用时间长，在宫腔内可保持至少21 d的持续作用[17]。Amer等[18]应用新鲜羊膜+球囊治疗重度IUA，术后2个月宫腔镜探查，取原瘢痕处的组织进行检测，在电镜下发现子宫内膜基底细胞，在退化的羊膜上亦发现子宫内膜基底细胞，说明术后7 d取出球囊后，羊膜仍能继续发挥作用。来源于羊膜的上皮细胞及间充质细胞已被证实可存活几周，这个时期足以对抗新的创面纤维化和瘢痕愈合的周期。

单纯应用球囊后IL-1、TNF-α和VEGF的浓度均处于较高水平，说明创面持续分泌粘连相关细胞因子，球囊取出后，屏障介质消失，宫腔前后壁的创面受到粘连因子的影响，合成过量的ECM，加重纤维化的发生，从而再次发生粘连。应用羊膜制品后IL-1、TNF-α和VEGF的浓度在术后11个时间点均低于对照组相应时间点的浓度，说明羊膜制品可持续抑制细胞因子的释放，在术后最初7 d的渗出期起到关键作用。本研究结果显示羊膜制品能有效降低IL-1、TNF-α和VEGF峰值浓度以及平均浓度，可避免创面持续暴露在一个高水平的粘连因子环境中。研究组中TNF-α和VEGF均能在术后7 d明显减少，虽然IL-1未在术后7 d明显降低，但已经开始呈现下降趋势，取出球囊后，羊膜持续发挥作用，除屏障介质等作用外，仍可以继续抑制粘连因子的释放。

需要提出的是，目前临床使用的羊膜制品依然存在诸如形态尺寸不能与子宫腔形态相适应等问题，限制其临床推广使用。尽管如此，本研究对羊膜制品的使用和作为重度IUA手术后再粘连的预防与干预进行探讨，可能为TCRA术后宫腔创面再粘连的预防提供新的思路和方法，羊膜制品在重度IUA手术中的效果仍需要展开前瞻性、多中心和大样本的研究证实。

1 中华医学会妇产科学分会.宫腔粘连临床诊疗中国专家共识.中华妇产科杂志,2015,50(12):1-8.

2 Yu D, Wong YM, Cheong Y, et al. Asherman syndrome-one century later. Fertil Steril, 2008,89(4):759-779.

3 邵 毅,苗春云,余 瑶,等.生物技术与移植医学的里程碑—羊膜.中国医药科学,2011,1(17):9-11.

4 Amer MI, Abd-El-Maeboud KH. Amnion graft following hysteroscopiclysis of intrauterine adhesions. J Obstet Gynaecol Res， 2006, 32(6):559-566.

5 Amer MI, Abd-El-Maeboud KH, Abdelfatah I, et al. Human amnion as a temporary biologic barrier after hysteroscopic lysis of severe intrauterine adhesions: pilot study. J Minim Invasive Gynecol， 2010,17(5):605-611.

6 王 欣,段 华.羊膜制品在重度宫腔粘连治疗中的应用及疗效分析.中华妇产科杂志,2016,51(1):27-30.

7 刘 芸,段 华.GnRH-a治疗对中重度宫腔粘连手术结局的影响.中国微创外科杂志,2014,14(6):522-525.

8 陶 址,段 华.宫腔镜粘连分离术后创面渗出液中粘连相关细胞因子浓度的动态分析.中华妇产科杂志,2012,47(10):734-737.

9 慕庆玲,肖松舒,万亚军.生长因子在宫腔粘连形成中的作用.中国妇产科临床杂志,2014,15(3):286-288.

10 Lennard CM, Mann EA, Sun LL, et al. Interleukin-1 beta, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in chronic sinusitis：response to systemic eorticosteroids. Am J Rhinol, 2000,14(6):367-373.

11 韩义娜,任琛琛,申爱荣, 等.VEGF在宫腔粘连患者子宫内膜中的表达及与IL-18、TNF-α的关系.中国妇幼保健,2011,26(29):4497-4499.

12 孔丽萍,吴剑波.TNF-ɑ和VEGF在羊膜移植治疗兔眼碱烧伤中的表达.中国实用眼科杂志,2007, 25(4):448-450.

14 Grzetic-Lenac R, Merlak M, Balog T, et al. Transplantation of amniotic membrane in corneal ulcers and persistent epithelial defects. Coll Antropol,2011,35(2):167-169.

15 华 萍,涂桂林,余万霰,等.冷冻干燥对羊膜组织形态与生物活性因子的影响.南昌大学学报(医学版),2010,50(4):43-46.

16 Orhue AA, Aziken ME, Igbefoh JO. A comparison of two adjunctive treatments for intrauterine adhesions following lysis. Int J Gynaecol Obstet,2003,82(1):49-56.

17 Trelford-Sauder M, Trelford JD, Matolo NM. Replacement of the peritoneum with amnion following pelvic exenteration. Surg Gynecol Obstet,1977,145(5):699-701.

18 Amer MI, Abd-El-Maeboud KH, AlloubA, et al. Amnion graft as a possible source of stem cells for endometrial regeneration after lysis of severe intrauterine adhesions. MEFS,2012,17(1):54-56.

(修回日期：2016-08-12)

(责任编辑：李贺琼)

Effects of Human Amniotic Membrane on Cytokines in Uterine Cavity Effusion After Trans-cervical Resection of Adhesions

ZhuXinyu,DuanHua*,WangXin*,etal.

*GynecologicalMinimallyInvasiveCenter,BeijingObstetricsandGynecologyHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100006,China

DuanHua,E-mail:duanhua888@163.com

Amniotic membrane; Intrauterine adhesions; Trans-cervical resection of adhesions; Tumor necrosis factor-α; Vascular endothelial growth factor; Interleukin-1; Re-formation of adhesions

首都卫生发展科研专项(2014-1-2112)；北京市医院管理局医学发展专项(“扬帆计划”zylx201406)

**通讯作者，E-mail:duanhua888@163.com

①现工作单位：中国人民武装警察部队北京市总队医院妇产科，北京 100027

A

1009-6604(2016)10-0922-06

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.10.015

2015-08-25)

【Summary】 Objective To investigate effects of amniotic membrane on the concentration of adhesion-related cytokines in uterine cavity effusion after trans-cervical resection of adhesions (TCRA). Methods A total of 30 severe intrauterine adhesions (IUA) patients receiving TCRA were randomly allocated into either Amniotic Membrane Group (n=15) or Control Group (n=15). After complete separation of adhesion, a Foley balloon catheter with amniotic membrane was inserted into the uterine cavity in the Amniotic Membrane Group, while a Foley balloon catheter was inserted into the uterine cavity for patients in the Control Group. The uterine cavity effusion of each patient was collected at the 3, 6, 9, 12, 24, 48, and 72 hours and on the 4, 5, 6, and 7 days after TCRA. The total effusion volume and the concentration of tumor necrosis factor-α (TNF-α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin-1 (IL-1) in the uterine cavity effusion were detected. Results The total effusion volume postoperatively in the Amniotic Membrane Group was significantly lower than that in the Control Group [(30.6±18.2) ml vs. (62.7±32.9) ml,t=-3.307,P=0.003]. On day 7 the effusion volume was significantly lower than that at 48 hours, which reached peak concentration [median (min-max): 5.50 ml (0.50-13.00 ml)] in the Amniotic Membrane Group (χ2=15.691,P=0.000). Meanwhile, on day 7 the effusion volume was significantly lower than that on day 4, which reached peak concentration [11.50 ml (3.00-23.00 ml)] in the Control Group (χ2=9.549,P=0.002). The effusion volume on day 7 in the Amniotic Membrane Group [1.00 ml (0.00-2.00 ml)] was significantly lower than that in the Control Group [6.50 ml (5.00-8.00 ml),Z=-4.666,P=0.000]. The peak TNF-α concentration in the Amniotic Membrane Group at 48 hours was (279.35±29.52) ng/L and decreased to (243.56±43.99) ng/L on day 7 postoperatively (q=3.990,P<0.05). In the Control Group the TNF-α concentration reached peak value at 48 hours (309.18±35.20) ng/L and dropped to (285.06±38.20) ng/L on day 7 (q=2.485,P>0.05). The peak VEGF concentration in the Amniotic Membrane Group at 72 hours postoperatively was (629.24±101.38) ng/L and was reduced to (428.16±104.35) ng/L on day 7 postoperatively (q=6.974,P<0.05). In the Control Group the VEGF concentration reached peak value at 24 hours (713.47±110.20) ng/L and dropped to (564.59±119.92) ng/L on day 7 (q=5.169,P<0.05). The IL-1 concentration in the Amniotic Membrane Group reached peak value on day 6 postoperatively (84.41±16.31) ng/L, with no significant difference as compared with day 7 [(80.62±14.77) ng/L,q=0.923,P>0.05]. In the Control Group the peak IL-1 concentration was obtained on day 5 (101.35±19.53) ng/L and there was no significant difference between day 5 and day 7 [(89.89±13.83) ng/L,q=2.736,P>0.05]. Conclusions The application of amniotic membrane can significantly reduce the amount and duration of uterine effusion after TCRA, lowering the concentration of TNF-α, VEGF and IL-1 in the uterine cavity effusion to a certain extent. The preliminary data showed that using amniotic membrane following TCRA can reduce the risk of re-formation of adhesions.