5个石榴品种杂交F1代分析研究初探*

王艳，杨荣萍，张旻威，洪明伟，李松开，张赛赛，井锐锐，姜勤，李文祥

(1.云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南省蒙自市果疏技术推广站，云南 蒙自 661100；3.云南省通海县经济作物工作站，云南 通海 652700)

5个石榴品种杂交F1代分析研究初探*

王艳1，杨荣萍1，张旻威1，洪明伟1，李松开2，张赛赛1，井锐锐1，姜勤3，李文祥1

(1.云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南省蒙自市果疏技术推广站，云南 蒙自 661100；3.云南省通海县经济作物工作站，云南 通海 652700)

为探讨软籽石榴杂交后代生活力较低的原因，以6年生河南突尼斯软籽石榴、云南建水红珍珠石榴和云南建水红玛瑙石榴为父本，云南甜光颜石榴和云南甜绿籽石榴为母本，设计6个杂交组合进行杂交授粉。结果表明，得到杂交F1代种子，其中杂交组合①河南突尼斯软籽石榴♂×云南蒙自甜光颜石榴♀和⑤云南建水红珍珠石榴♂×云南蒙自甜绿籽石榴♀的坐果率较高，分别为65%和57%，出现杂交亲和性，并具有亲本优势，可培育出F1代实生苗木，从而培育新的石榴品种资源。

石榴；杂交F1代；胚活性；坐果率

石榴(PunicagranatumL.)为石榴科(Punicaceae)(安石榴科)石榴属(Punica)落叶灌木或小乔木植物[1]。自20世纪70年代以来，中国石榴研究的开展越来越多，对国内石榴资源进行了调查、收集、分类等诸多研究工作。初步调查得到中国南北各地现有品种资源150多个，其中结实品种140多个[2]。全国著名的产地有：山东的枣庄、陕西的临潼、新疆的叶城、安徽的怀远、云南的巧家、蒙自、建水、禄丰和四川的会理等地[3]。并通过长期的人工栽培和驯化得到6个变种：白石榴、红石榴(四瓣石榴)、重瓣石榴、月季石榴(四季石榴)、墨石榴和彩花石榴(玛瑙石榴)[4～7]。近几年杂交育种的相关研究得到重视，杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型，为选择提供丰富的材料；基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。而在石榴栽培生产中，常用扦插、分株、压条进行繁殖，虽然可以保留品种的优良特性，但是对新品种的发现，有关石榴种质创新方面的研究较少[8～9]。因此，本试验设计6个杂交组合进行杂交授粉，测定种子活性及出苗率，观察石榴杂交授粉后实生苗木的优良特性，为培育新的石榴品种资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在云南省蒙自市草坝果树示范园进行。试验地位于云南省红河州蒙自县西北部，103°23′E,23°23′N，海拔1 260m。属于南亚热带气候类型，年均日照2 334h，日照率51%，全年≥10℃积温6 255℃，无霜期337天，年平均温度18.8℃。地势东南高、西北低，东以犁耙山为屏障，南、北、西三面为丘陵环绕，具有良好的石榴栽培条件。蒙自市的石榴栽培主要分布在新安所、文澜、草坝和雨过铺4个乡镇，主栽品种为甜绿籽石榴、甜光颜石榴、厚皮甜砂籽石榴3个。

1.2 试验材料

试验材料选择6年生的5个石榴品种，以河南突尼斯软籽石榴、云南建水红珍珠石榴和云南建水红玛瑙石榴为父本，云南蒙自甜光颜石榴和云南蒙自甜绿籽石榴为母本。河南突尼斯石榴为软籽石榴品种，果粒深紫色，花红色。云南建水红珍珠石榴和云南建水红玛瑙石榴为酸甜半软籽石榴品种，果粒鲜红色，花红色。云南蒙自甜光颜石榴和云南蒙自甜绿籽石榴，为半软籽石榴品种，果粒浅粉红色，花红色[10]。选择树体健壮，生长势好，花期接近，并且花粉活性高，单果较重，果皮色泽鲜艳(主要为红色)的石榴品种。

1.3 试验设计

试验设计6 个杂交处理 ①河南突尼斯软籽石榴♂×云南蒙自甜光颜石榴♀;②河南突尼斯软籽石榴♂×云南蒙自甜绿籽石榴♀;③云南建水红珍珠石榴♂×云南蒙自甜光颜石榴♀;④云南建水红玛瑙石榴♂×云南蒙自甜光颜石榴♀;⑤云南建水红珍珠石榴♂×云南蒙自甜绿籽石榴♀;⑥云南建水红玛瑙石榴♂×云南蒙自甜绿籽石榴♀。

1.4 试验方法

1.4.1 杂交试验

于2015年3月20日蒙自县甜绿籽石榴和甜光颜石榴开花初期(5%的花朵开放)，在每个品种的2株树上选取花序数较多的4个主枝进行标记，摘掉开放的花朵，每个主枝保留10朵没开放的花朵，去雄蕊进行人工授粉后套袋。

(1)去雄、授粉、套袋 授粉时间选择晴天上午7：00-10：00，采集父本未完全开放的花朵，取其花粉。在母本中选择10朵未开放花朵，用锋利小刀纵切并轻轻打开花冠，割掉雄蕊，用毛笔蘸取培养皿中父本石榴花粉，授于母本柱头上，触碰4～5次，授粉结束立即套袋[11]。同时，在同株母本上选择10朵未开花朵进行自然授粉，挂吊牌记录，不作任何处理。授粉15～30天后，去袋即可。

(2)花粉活力测定、胚活力测定-TTC染色法 采集父母本的花朵，测定其花粉活性。分别取少量花粉放在载玻片上，滴1～2滴TTC溶液，用镊子将其搅拌均匀，盖上盖玻片，并将此玻片置于35～40℃下培养15～20min。凡被染成红色的花粉均表示其具有生活力[12]。在显微镜下观察3个不同视野，统计并计算花粉生活力[13～14]。其计算公式为，花粉活力=视野内被染色的花粉数/花粉总数×100%。

采集6个杂交组合的果实获得种子及亲代，测定胚活力。将种子浸泡24h后，沿胚轴线切开，同样采用TTC染色法进行染色，凡被染成红色的种胚均表示其具有生活力。在显微镜下观察3个不同视野，统计并计算种胚生活力[15]。其计算公式为，胚活力=视野内被染色的种胚数/种胚总数×100%。

1.4.2 坐果率测定

坐果率为果树上结果数占开花总数的百分率[16]。到9月中旬果实成熟后，测定坐果率。其计算公式为，坐果率=果树结实数/开花数×100%。

1.4.3 子代测定

(1)催芽与实生苗繁育 将浸泡过24h的种子，先沥去或晾干种皮上多余的水，使种皮成湿润状，然后用热水烫过的纱布包起种子。将种子放于20～30℃的恒温箱中进行催芽。种子露白后即可播种。基质由珍珠岩与草炭按2︰5的比例混配[17]。1个月后统计实生苗出苗率。其计算公式为，出苗率=出苗数/播种数×100%。

(2)石榴种子形态测定 用游标卡尺测量石榴种子的长度、宽度、厚度和种皮厚度，每个处理测定10粒种子，记录数据，计算标准方差。将石榴种子浸泡24h后，沿种缝线切开，在体视镜下观察、拍照。种子大小参照刘长江的方法[18]进行观察描述；种子形状和颜色主要参照“CMYK印刷专用精选色谱”[19]方法进行观察描述。

2 结果与分析

2.1 亲本的花特征及花粉活力

石榴完全花为两性花，一般1朵至数朵着生在当年新梢顶端及项端以下的叶腋间；萼片硬，肉质，管状，5～7裂，与子房连生；花瓣倒卵形，与萼片同数而互生，覆瓦状排列。花朵分为单瓣和重瓣[20]，重瓣品种雌雄蕊多瓣花而不孕，花瓣多达数十枚；花多红色，也有白色和黄、粉红、玛瑙等色。雄蕊多数，花丝无毛。雌蕊具花柱1个，长度超过雄蕊。花粉是种子植物花粉粒的总称，含有大量的营养物质和生理活性物质，如淀粉、葡萄糖、果糖、维生素和酶等。花粉保存于温度0～5℃且黑暗条件下为宜。

通过花粉活力、胚活力的测定可以了解种子的可育性[21～22]，并掌握不育花粉的形态和生理特征，进行杂交技术的改良。因此通过测定5个亲本的花粉活力，预测授粉情况。由表1得出，5个亲本的花粉活力都较高，其中作为父本的红珍珠、红玛瑙和突尼斯的花粉活力分别为84.66%、87.15%和89.14%，可保证授粉试验的顺利进行。在授粉时将作为母本的甜绿籽和甜光颜的雄蕊处理干净。

表1 5个杂交亲本的花粉活力

2.2 5个杂交F1代与亲本相关生理指标测定

果树开花结果过程中，常因授粉受精不完全，外界环境条件不良和栽培管理不当等原因而引起落花落果，使坐果率较低[23～26]。通过测定杂交果实和亲本果实的生理指标(可溶性糖、果形指数)，得出杂交果实的不同特点。

实生苗是直接由种子繁殖的苗木，具有生长旺盛、根系发达、寿命较长等特点；用作繁殖材料时来源丰富，方法简便，成本低廉。因而实生繁殖迄今仍是植物栽培中最主要的育苗方法。在杂交育种中，也需要利用杂种实生苗后代分离的特性来选育新品种[27]。

表2 杂交种与亲本的主要性状

由表2得出，杂交设计①、③、⑤的果肉颜色，出现父本性状；④的果粒数增多；⑤、⑥的果形指数增大。杂交种总体坐果率较低，①、⑤坐果率最高，在50%以上，分别为65%和57%。同时杂交种的胚活力增强，用与亲本同样方法催芽，出芽较快，可获得高出苗率的实生苗。结果表明，杂交种可以保留亲本的优良特性，提高种子的配合力，并为F2代杂交育种奠定基础。

2.3 杂交组合方差分析

对6个杂交处理进行方差分析[28]可知(见表3和表4)，在95%和99%置信水平下杂交组合①与⑤均不显著，而与②、③、④、⑥均有显著性，坐果率达到65%，相比其他组合具有较高的坐果率。在99%的置信水平下，杂交组合①平均坐果率显著高于②、③、④；在95%置信水平杂交组合②与⑥显著高于①与⑤，③、④、⑥之间差异不显著，其中③的坐果率最低，仅为20%。

表3 杂交组合间坐果率的方差分析

表4 杂交组合间的多重比较

2.4 种子的形态特点

各品种及杂交种的种子形态特征测量结果见表5、图1和图2。亲本与杂交品种的种子形状、种皮颜色、种胚颜色和种子的长、宽、厚差异均不明显，而种皮厚度差异明显。杂交处理④红玛瑙♂×甜光颜色的种皮厚度数值最低，为0.031±0.008。红玛瑙和红珍珠种皮较硬，杂交种和甜光颜、甜绿籽适中，突尼斯品种最软。

根据杨万林的石榴籽粒硬度测定结果[29]，以及本试验测量的种皮厚度，可以得出突尼斯石榴为软籽石榴品种，甜绿籽、红光颜、红珍珠、红玛瑙4个石榴品种为半软籽石榴品种。6个杂交种处于软籽与半软籽之间，可作为新品种进行进一步培育。

表5 种子形态特征测定

1234567891011

图1 亲本与杂交种果粒颜色对比

图2 种子形态特征

注：1为月季石榴;2为突尼斯;3为甜光颜;4为红珍珠;5为甜绿籽;6为云南建水红玛瑙♂x云南甜绿籽♀;7为云南建水红玛瑙石榴♂×云南甜光颜♀;8为红玛瑙;9为云南建水红珍珠石榴♂×云南甜光颜♀;10为云南建水红珍珠石榴♂×云南甜绿籽♀;11为河南突尼斯软籽石榴♂×云南甜光颜♀;12为河南突尼斯软籽石榴♂×云南甜绿籽♀

Fig.2 Morphological characteristics of different seeds

3 结论与讨论

试验得出杂交F1代种子的配合力都在40%以上，有利于下一步进行实生苗繁殖，培育新品种。并且，杂交F1的果实出现亲本优势，①、②、③3个杂交处理的果肉颜色加深，均出现父本的优良性状(说明花粉直感作用明显)。在6个处理的坐果率方差分析中，处理⑤和①分别为57%和65%，表现最为显著，显著高于处理组合③、④和⑥。

试验以河南突尼斯软籽石榴、云南建水红珍珠和云南建水红玛瑙石榴为父本，云南蒙自甜光颜石和云南蒙自甜绿籽石榴为母本，是根据南北方不同石榴品种、云南省酸甜不同口感石榴品种进行杂交，得到的是F1代杂交种，通过对F1代进行大量的实生苗种植，从中筛选优良性状进行培养，有望得出综合了亲本优良性状的新品种。

然而研究结果应用有限，对于其他石榴品种做母本的杂交育种，必须要对相关品种进行试验研究。同时，在此杂交试验中，6个杂交处理的坐果率偏低，需要进一步调查花瓣、自体雄蕊和套袋对杂交结实的影响。

[1]陈德均.我国石榴的种质资源及地理分布[J].河南科技，1989(1):18-19.

[2]陈丽娟.中国石榴品种资源种子硬度形状研究平[J].安徽农业大学学报,2006,33(3):356-359.

[3]梁玉英,赵名花,李小娟.突尼斯软籽石榴引种及栽培技术研究[J].经济林研究,2001,19(3):42-43.

[4]曾玉红,白玉琼,曾玉萍.蒙自枣锈病的发生规律及防治[J].吉林农业,2011(4):254.

[5]Yoshioy ,Xueton G F,Maxp.Fuji Apple[J].Fruit Varieties Journal,1995,49(4):194-197.

[6]Susan K B,David E T.The Cornell University Apple Breeding Pro-gram:Past,Present,and Future[J].Fruit Varieties Journal,1997,51(4):199-204.

[7]Williams C,Fohnson.Apple Rootstock Breeding and Evaluation Program[C].The 42nd Annual IDFTIA Conference,1999:20-24.

[8]赵丽华,李名扬,王先磊,等.石榴种质资源多样性及亲缘关系的ISSR分析[J].果树学报,2011,28(1):66-71.

[9]吴中军,夏晶晖.成熟期石榴果实营养成分的变化[J].果树学报,2001，18(5):308-309.

[10]李俊梅.突尼斯软籽石榴在云南会泽的栽植表现[J].中国果树,2011(5):57-58.

[11]邓丰产,马锋旺,邹养军,等.苹果杂交授粉方法的比较研究[J].北方园艺,2009(9):4-6.

[12]尤扬,贾文庆.西府海棠花粉生活力测定[J].安徽农业科学,2011,39(6):3423-2425.

[13]付润民,黄智敏.苹果新品种“秦冠”[J].陕西农业科学,1989(4):40.

[14]刘程宏,张方明,宋尚伟.石榴花粉生活力测定方法[J].江西农业学报,2012,24(1):15-16.

[15]沈德绪.果树育种实验技术[M].北京:中国农业出版社,1992:39-42.

[16]吴中军.不同套袋条件对石榴品质的影响[J].湖南农业科技通讯,2004,5(2):17-19.

[17]上海植物生理学会.植物生理学实验手册(1版)[M].上海:上海科学技术出版社,1985:328-329.

[18]刘长江.十字花科芸薹属和欧白芥属种子的扫描电镜观察[J].园艺学报，1985,12(4):249-254.

[19]段鹏娜.爵床科植物种子形态特征及其分类学研究[D].南京:南京林业大学,2013.

[20]纪百惠.石榴籽和石榴皮生物活性成分的研究[D].无锡:江南大学,2013.

[21]徐蕊,胡国平,李玉娟,等.矮生紫薇催芽技术研究[J].安徽农业科技,2014,4(32):11366-11367.

[22]马齐,秦涛,王丽娥,等.石榴的营养成分及应用研究现状[J].食品工业科学，2007(2):66.

[23]乜兰春,孙建设,黄瑞虹.果实香气形成及其影响因素[J].植物学通报,2004,21(5):631-637.

[24]Melgarejo P,Salazar D M,Arts F.Organic acids and sugars composition of harvested pomegranate fruits[J].European Food Research Technology,2000,211(3):185-190.

[25]金晓瑾,殷晓松,许毅涛.不同光照和土壤水分对3种龙脑香科植物种子发芽的影响[J].西部林业科学,2015,44(1):37-40.

[26]曾宋君,吴坤林,张建霞,等.国兰新品种的选育和杂交育种研究进展[J].中国野生植物资源,2013,32(1):1-5.

[27]侯祥云,郭先锋.芍药属植物杂交育种研究进展[J].园艺学报,2013,40(9):1805-1812.

[28]幸伟年,周文才,龚春,等.油茶杂交育种试验[J].经济林研究,2010,28(3):95-99.

[29]杨万林,杨芳.中国优质石榴品种品质比较研究[J].保鲜与加工,2015,15(6):62-67,72.

F1 Generation Cross Seeding of FivePunicagranatumL.Cultivars

WANG Yan1,YANG Rong-ping1,ZHANG Min-wei1,HONG Ming-wei1,LI Song-kai2,ZHANG Sai-sai1,JING Rui-rui1,JIANG qin3,LI Wen-xiang1

(1.The College of Horticulture and Landscape in Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.The Horticulture Station of Mengzi City Yunnan Province,Mengzi Yunnan 661100,P.R.China;3.The Horticulture Station of Tonghai City Yunnan Province,Tonghai Yunnan 652700,P.R.China)

To understand the low survival rate of hybrid generation,hybridization pollination among 6 different pomegranate cultivars was conducted by selecting 6-year-old Tunisia pomegranate from Henan Province,pink pearl pomegranate and onyx pomegranate from Yunnan Province as male parent,Tianguangyan pomegranate and Tianlvzi pomegranate of Yunnan province as female parent.The results showed that the F1 hybrid generation ①Henan Tunisia soft seeds pomegranate♂×Yunnan Tianguangyan ♀ and ⑤Yunnan Jianshui sweet pink pearl pomegranate♂×Yunnan Tianlvzi♀ could higher fruit production compared with other combinations,namely 65% and 57% respectively.These two combinations also showed hybrid affinity with their parents,therefore they could produce the F1 seedlings,and cultivate new varieties of pomegranate resources.

PunicagranatumL.;F1 hybrid generation; seed vigor; fruit setting rate

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.013

2016-01-21

云南农业大学第七届学生科技创新创业行动基金项目(2014ZKX041)。

王艳(1990-)，女，硕士研究生，主要从事果树栽培生理研究。E-mail：13592640758@163.com

简介： 李文祥(1959-)，男，教授，主要从事果树生理及栽培方面的教学和科研工作。

E-mail:liwenxiang1959@sina.com

S 665.4

A

1672-8246(2016)06-0073-06