葡萄叶乙醇提取物的提取工艺及体外抑菌活性研究*

库尔班江·巴拉提

(新疆伊犁师范学院 化学与环境科学学院,新疆 伊宁 835000)

葡萄叶乙醇提取物的提取工艺及体外抑菌活性研究*

库尔班江·巴拉提

(新疆伊犁师范学院 化学与环境科学学院,新疆 伊宁 835000)

为优选出葡萄叶乙醇提取物的最佳提取工艺条件，以采自吐鲁番市恰特喀勒乡的葡萄叶为材料，采用索氏提取器回流提取法提取葡萄叶乙醇提取物；工艺优化以乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比为影响因素，分别用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌做抑菌试验，并以其中抑菌效果最明显的金黄色葡萄球菌为指示菌，以葡萄叶乙醇提取物的抑菌圈直径为指标，在单因素试验的基础上采用了正交试验，并用K-B琼脂扩散法测定其体外抑菌活性。结果表明，各因素对提取葡萄叶抑菌活性物质的影响顺序为，乙醇浓度>浸提温度>料液比>浸提时间。最佳提取工艺为，乙醇浓度70%、浸提温度70℃、料液比1︰30、浸提时间3h。在最佳提取条件下获得的葡萄叶提取物对4种菌的抑菌作用大小为：金黄色葡萄球菌﹥大肠杆菌﹥白假丝酵母菌﹥枯草芽孢杆菌。葡萄叶中乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较显著的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌抑菌活性最大，而对枯草芽孢杆菌的抑菌作用不太显著。本文所建立的葡萄叶乙醇提取物的最佳提取工艺具有渐变快速、仪器设备简单、不污染环境等优点，可用于葡萄叶中具有抗菌活性物质的提取。

葡萄叶；乙醇提取物；索氏提取器回流提取法;金黄色葡萄球菌;单因素试验；正交试验；抑菌活性

葡萄(VitisviniferaL.)是葡萄科(Vitaceae)葡萄属(VitisL.)落叶藤本植物，是世界最古老的植物之一。葡萄在我国大部分地区均有栽培，尤其是新疆葡萄资源非常丰富[1～2]。葡萄叶是一种传统的中药材，可治呕吐、水肿、小便不利、目赤等症[3～5]。根据文献报道，葡萄叶含有丰富的具有高生理活性的黄酮类、有机酸、鞣质类、低聚芪类等化合物[3,5]。葡萄叶在土耳其、希腊及中东一带大都作为烹饪材料，其中最有名的菜是多马西(dolmasi)，以葡萄叶包米和绞肉的菜肴[6～8]。我国葡萄植物资源丰富，但大量的葡萄叶资源尚未得到充分的开发利用。周璇等对蔬菜、花卉、树木、作物和杂草中的29科73种植物提取物抑菌活性进行了筛选，发现葡萄叶提取物有很强的抑菌活性[9～13]。本文以葡萄叶为原料，以70%乙醇为提取剂，以葡萄叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)的抑菌圈直径为考察指标，在单因素试验基础上采用正交试验优化了提取条件，并测定了乙醇提取物的体外抑菌活性，为葡萄叶抑菌活性物质的提取及不同溶剂提取物抑菌活性比较提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

BL-75A立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；DHG-9030电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；SHA-B多功能恒温振荡器(江苏金坛市正基仪器有限公司)；HZQ-X100A恒温振荡培养箱(上海一恒科技有限公司)；BSP-250生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；FW80高速万能粉碎机(北京市光明医疗仪器厂)；ZHJH-2109C智能型水平超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.2 材料与试剂

1.2.1 葡萄叶

2013年9月18日采自吐鲁番市恰特喀勒乡，自然晾干、于电热恒温鼓风干燥箱中40℃避光干燥、粉碎后，4℃冷藏备用。

1.2.2 菌种

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、白假丝酵母菌(Canidiaalbicans)均购自北京莱耀生物科技有限公司。

1.2.3 培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、LB培养基、土豆培养基(PDA)等均购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂粉、蛋白胨均购自天津市英博生化试剂有限公司；牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖购自天津市天新精细化工开发中心；无水乙醇(A.R.)购自成都市科龙化工试剂厂。其余试剂均为分析纯。

1.3 研究方法

1.3.1 单因素试验

将葡萄叶置于50℃热空气干热消毒箱内烘干、粉碎、过60目筛后，分别称取葡萄叶粉末若干份(每份约2g)，置于250mL的索氏提取器中，分别用不同浓度的乙醇(50%、60%、70%、80%)、不同提取时间(1h、2h、3h、4h)、不同提取温度50℃、60℃、70℃、80℃)及不同料液比(1︰20、1︰30、1︰40、1︰50)回流3.5h，提取液经减压蒸馏回收乙醇、真空干燥得葡萄叶乙醇提取物，提取物用无菌水溶解，定容至10mL、4℃冷藏备用。

金黄色葡萄球菌活化后，制成106～108CFU/mL菌悬液。采用牛肉膏蛋白胨琼脂扩散法，37℃培养24h后测定抑菌圈的大小。每个抑菌试验重复3次。

分别用不同浓度的乙醇为提取剂，以金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为考察指标，分别考察乙醇浓度、提取时间、提取温度及料液比对葡萄叶乙醇提取物抑菌活性的影响。

1.3.2 正交试验

以金黄色葡萄球菌抑菌圈效果为指标，确定提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间4个因素。将葡萄叶置于50℃热空气干热消毒箱内烘干、粉碎、过60目筛后，分别称取葡萄叶粉末若干份(每份约2g)，置于250mL的索氏提取器中，按4因素3水平L9(34)正交试验设计进行提取，提取物用无菌水溶解，定容至10mL、4℃冷藏备用。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母菌活化后,制成106～108CFU/mL菌悬液。细菌培养及抑菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，培养条件为37℃培养24h。白假丝酵母菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养条件为28℃培养24h。抑菌试验采用K-B琼脂扩散法，每个抑菌试验重复3次。

采用正交试验设计助手Ⅱ(v3.1)，对9组试验数据进行分析，确定各因素对抑菌的影响，得到最优提取条件。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对抑菌效果的影响结果

精确称取葡萄叶粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比分别加入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在温度为70℃下提取3h。提取液用旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，得到干燥的提取物浸膏，提取物用无菌水溶解并定容至5mL，用4种提取液分别做对金黄色葡萄球菌的抑菌试验，结果见表1和图1。

表1 乙醇浓度对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

图1 乙醇浓度对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the antibacterial activity

从图1可以看出，随着乙醇浓度的提高，葡萄叶提取物的抑菌活性呈现先增后减的趋势。当乙醇浓度为70%时，葡萄叶提取物抑菌圈平均直径最大，为13.54mm。当乙醇浓度高于70%时，葡萄叶提取物的抑菌活性降低，可能是随着乙醇浓度的提高，脂溶性物质溶出增加，对抑菌效果有一定的影响。因此，乙醇浓度为70%较合适。

2.2 料液比对抑菌效果的影响结果

精确称取葡萄叶粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，分别按1︰20、1︰30、1︰40、1︰50料液比，加入70%乙醇在温度为70℃下提取3h；提取液按2.1的方法操作分别做抑菌试验，4种提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表2和图2。

表2 料液比对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

图2 料液比对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

Fig.2 Effect of material liquid ratio on the antibacterial activity

由图2可知，随着料液比的增大，抑菌圈直径也在逐渐增大。在料液比为1︰50时，抑菌圈平均直径最大，为13.27mm。由图2可以看出，当料液比为1︰20时，葡萄叶提取物的抑菌活性较低，这可能是当料液比较小时，很难将葡萄叶中的抑菌活性物质充分溶解在提取溶剂中。当料液比在1︰30至1︰50时，抑菌圈的平均直径差异并不显著，在料液比为1︰30时，提取物就可以达到比较好的抑菌效果，再增加提取溶剂的用量对其抑菌效果不大。考虑到生产成本，确定料液比1︰30为宜。

2.3 提取时间对抑菌效果的影响

精确称取葡萄叶粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比，加入70%乙醇在温度为70℃下分别提取1h、2h、3h、4h；提取液按2.1的方法操作分别做抑菌试验，4种提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表3和图3。

表3 不同提取时间对抑菌效果的影响

图3 浸提时间对葡萄叶提取液抑菌活性的影响

Fig.3 Effect of extraction time on the antibacterial activity

从图3可以看出，随着提取时间的延长，葡萄叶提取物的抑菌活性先增大后减小。在提取时间为3h时，抑菌效果最佳，测量抑菌圈平均直径为12.91mm。当提取时间小于3h时，抑菌效果不明显，可能是由于加热时间短，葡萄叶内的抑菌活性物质未被充分浸提。当时间大于3h时，葡萄叶提取物的抑菌活性有下降的趋势，可能是由于提取时间过长，少部分乙醇受热挥发而导致沸点逐渐增大，从而破坏了提取物中的某些活性物质，使抑菌活性降低。综上考虑，选择提取时间为3h。

2.4 提取温度对抑菌效果的影响结果

精确称取葡萄叶粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比，加入70%乙醇，在温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃下提取3h；提取液按2.1的方法操作分别做抑菌试验，4种提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表4和图4。

表4 提取温度对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

图4 浸提温度对葡萄叶提取物抑菌活性的影响

Fig.4 Effect of extraction temperature on the antibacterial activity

从表4可以看出，随着提取温度的升高，葡萄叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性先增大后减小。在提取温度为70℃时，抑菌效果最明显，平均抑菌圈直径为13.86mm。在50℃～60℃之间，随着提取温度的升高葡萄叶乙醇提取液的抑菌活性逐渐增大。这可能是因为随着温度的升高，葡萄叶粗提物中抑菌活性物质的提取除了具有溶解效应以外，还有热效应，在一定温度下有利于其溶解，使提取效率得到提高，从而具有更好的抑菌效果。当提取温度高于70℃后，其抑菌活性又逐渐减小，可能是当温度超过70℃时，会造成葡萄叶中抑菌物质在过高温度下，活性下降或失去活性。并且考虑到乙醇溶剂的沸点较低，在高温时其会挥发加剧，使整个溶剂系统的极性过大，影响到浸提效果，导致抑菌效果不佳。故根据试验结果选择70℃为最佳提取温度。

2.5 正交试验结果及分析

在试验中，由于各因素之间相互交叉影响，因此为全面考虑乙醇提取法的工艺参数，根据单因素试验的结果，确定以乙醇浓度、料液比、浸提时间与提取温度4种因素进行4因素3水平L9(34)正交试验，优选最佳提取条件。

通过正交试验设计助手Ⅱ(v3.1)软件，对9组试验数据进行分析，得到的正交试验结果直观分析见表5。由表5中极差(R)分析得到，提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间4个因素对葡萄叶乙醇提取物抑菌活性影响的大小为，乙醇浓度>浸提温度>料液比>浸提时间。根据正交试验结果，葡萄叶中提取抑菌活性成分的最佳提取工艺条件为A2B2C3D2，即乙醇浓度70%、浸提温度70℃、料液比1︰40、提取时间3h。

2.6 最佳提取条件下的抑菌试验

通过正交试验，确定葡萄叶的最佳提取条件，

并在此条件下获得葡萄叶乙醇提取物，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母菌为供试菌，采用滤纸片法，严格按照无菌操作进行抑菌试验，通过3次重复试验，测得4种菌的抑菌圈直径见图5。

表5 葡萄叶乙醇提取物的 L9(34)正交试验设计结果

注：A为浸提温度(℃)；B为乙醇浓度(%)；C为料液比(料：液)；D为浸提时间(h)。

表6 最佳提取条件下对4种菌的抑菌效果比较

图5 最佳提取条件下对4种菌的抑菌效果比较

Fig.5 Comparison of antibacterial effect by 4 bacteria under optimum condition

由图5可以看出，在最佳提取条件下，葡萄叶乙醇提取物对4种菌的抑菌效果为，金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>白假丝酵母菌>枯草芽孢杆菌。

3 结论

通过试验证实葡萄叶中含有抑菌活性成分。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白假丝酵母菌都有较好的抑菌效果，但是对枯草芽孢杆菌的抑菌作用不太显著。从葡萄叶中开发出天然抑菌活性物质有一定的应用价值。但是抑菌活性成分的组成和化学结构，还需要进一步研究。

葡萄叶提取抑菌活性成分可以采用索式提取器回流提取法。提取抑菌活性成分最佳提取工艺条件乙醇浓度70%、浸提温度70℃、料液比1︰40、提取时间3h。

[1]库尔班江·巴拉提,王萌,张小莺.大孔树脂富集分离葡萄叶总黄酮的研究[J].食品安全质量检测学报,2015,6(3):1073-1079.

[2]孙磊磊,康健,邹积赟,等.葡萄叶复合茶的研制[J].食品科技,2014,39(11):59-61.

[3]孙磊磊,康健.响应面试验优化超声波法提取葡萄叶白藜芦醇工艺[J].食品工业,2015,36(5):16-19.

[4]张纵圆,彭秧.葡萄叶中总黄酮的提取工艺研究[J].生物技术,2007,17(6):58-60.

[5]边梅娜,李松泽,白红进,等.响应面法优化赤霞珠葡萄叶总黄酮的提取工艺[J].新疆农业科学,2013,50(11):2037-2045.

[6]孙磊磊,康健,邹积赟.响应面优化酶法辅助提取葡萄叶白藜芦醇工艺[J].食品科技,2015,40(2):276-281.

[7]毛俊霞,张文君,李曦默,等.响应面法优化葡萄叶中白藜芦醇的提取条件[J].天然产物研究与开发,2014,26(12):2027-2032.

[8]袁茜,周宝利,李之璞.不同提取条件对葡萄叶提取物抑制两种病原菌活性的影响[J].植物保护,2009,35(2):125-127.

[9]周璇,周宝利,李志文.抑制茄子黄萎菌的植物提取物的筛选[J].生态学杂志,2007,26(8):1217-1221.

[10]李欣,乔家驹,冯汉青,等.杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究[J].食品工业科技,2015,36(11):62-65.

[11]林雄平,周逢芳,陈晓清,等.石花菜和海蒿子提取物抗菌活性初步研究[J].亚热带植物科学,2011,40(1):28-30.

[12]王奎,冯颖,孙龙,等.美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分离和抑菌活性分析[J].林业科学研究,2013,26(2):163-166.

[13]杨玉,刘晓艳,吴枭瞭.竹荪乙酸乙酯提取物的抑菌作用研究[J].长江大学学报(自然科学版),2014,29(11):66-68.

Extraction Process and Vitro Antibacterial Activity of Grape Leaves’ Ethanol Extract

KORBANJHON Brad

(College of Chemistry and Environmental Sciences,Yili Normal University,Yining Xinjiang 835000,P.R.China)

To identify the optimum extraction process of ethanol extract from grape leaves,taking grape leaves collected Chatqal Township of Turpan city as research materials,Soxhlet extractor reflux extraction were used to extract ethanol.The optimum process conditions were studied based on antibacterial tests ofEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,CanidiaalbicansandBacillussubtiliswith consideration of several factors such as ethanol concentration,extraction temperature,extraction time and solid-liquid ratio.Orthogonal test was conducted based on single-factor test,and vitro antibacterial activity was measured through K-B agar diffusion method.In this test,the indicator bacteria wasStaphylococcusaureus,and the indictor was the diameter of bacterial inhibition zone.The results showed that the order of the factors that influence the antibacterial activity was ethanol concentration>extraction temperature>solid-liquid ratio>extraction time,and the optimum extraction process was 70% ethanol concentration,extraction temperature 70℃,solid-liquid ratio 1︰30,extraction time 3h.The influence order of ethanol extract on the antibacterial activity of the 4 selected bacteria wasStaphyloccocusaureus>Escherichiacoli>Canidiaalbicans>Bacillussubtilis,and among them,the ethanol extract had significant effect onStaphylococcusaureusandEscherichiacoli,but not significant forBacillussubtilis.

grape leaves;ethanol extract;Soxhlet extractor reflux extraction;Staphylococcusaureus;single factor test;orthogonal test;antibacterial activities

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.007

2015-12-28

伊犁师范学院科研项目基金资助项目(2013YLSYY003)。

库尔班江·巴拉提(1962-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中药与天然药物的研究。E-mail: korbanjhon@126.com

Q 946.8；R 284.2

A

1672-8246(2016)06-0037-06