超高压液相色谱-串联质谱测定渔业养殖环境中硝基呋喃代谢物

成强，陈京都，吴红军，王龙根

(扬州市农产品质量监督检测中心，江苏 扬州 225101)

超高压液相色谱-串联质谱测定渔业养殖环境中硝基呋喃代谢物

成强，陈京都*，吴红军，王龙根

(扬州市农产品质量监督检测中心，江苏 扬州 225101)

采用超高压液相色谱-三重串联四级杆质谱仪优化了渔业养殖水和底泥中4种硝基呋喃代谢物残留检测的方法。确定以2-硝基苯甲醛为衍生剂，样品经60 ℃高温振荡衍生4 h，再经乙酸乙酯提取，C18色谱柱分离，在正离子反应模式下以大气压电喷雾源电离，采用多反应监测，内标法定量。方法中4种硝基呋喃代谢物的检出限为0.1 ng/mL(g)，定量限为0.25 ng/mL(g)，在0.25～10 ng/mL(g) 线性范围良好，0.5、2.0、5.0 ng/mL(g) 3个添加水平回收率范围为91.3%～102.2%，相对标准偏差均小于10%。本方法具有重复性好、灵敏度高、简便、准确以及快速的优点，可以满足渔业养殖环境中硝基呋喃类药物残留的监控要求。[中国渔业质量与标准，2016,6(4):37-43]

硝基呋喃代谢物；液质联用；养殖环境；底泥；衍生温度

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，曾应用于畜禽及水产养殖业，用于治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸等毒性作用[1]，欧盟已于1995年起禁止在食用动物中使用硝基呋喃类药物[2]；中国农业部也于2002年12月发布第235号公告及2005年10月发布第560号公告[3-4]，禁止在饲养过程中使用硝基呋喃类药物，硝基呋喃类药物在动物性食品中不得检出。卫生部于2010年3月将硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质黑名单[5]。

硝基呋喃类原药在生物体内代谢迅速，其代谢产物分别为氨基脲(SEM)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基乙内酰脲(AHD)和3-氨基-2-恶唑烷基酮(AOZ)，这些代谢物易与蛋白质稳定结合，故常通过检测其代谢物的含量来反映硝基呋喃类药物的残留状况[6-7]。目前关于硝基呋喃代谢物残留研究多集中在动物可食性组织样品上[8-13]，常用的检测方法是酶联免疫法(ELISA )和液质联用法( LC-MS/MS )[14-16]，并已出台了相关检测标准[17]。在水产养殖中，硝基呋喃类药物的使用多为全池撒播，药物在养殖环境中残留直接影响到水产品的质量安全。然而，目前关于养殖环境中硝基呋喃代谢物残留分析的研究较少，且其方法较为复杂或时间较长[18-21]。因此，研究快速且准确检测养殖环境中硝基呋喃代谢物残留检测技术，可以从养殖源头监控其使用情况，为监管部门提供有力的技术支撑。

本研究对样品前处理方法、色谱条件以及质谱条件进行了优化，以期通过提高衍生温度、缩短衍生反应时间，来实现渔业养殖环境中4种硝基呋喃代谢物的超高压液相色谱-串联质谱测定。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

安捷伦1290-6460超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(Agilent公司)，并配有大气压电喷雾源(ESI)；恒温水浴振荡器(江苏金城国胜公司)；氮吹仪(北京莱伯泰科公司)；涡旋振荡器(IKA 公司)；离心机(Sigma公司)；电子天平(莆田亚太公司)。

实验所用的甲醇、乙腈为农残级；甲酸、乙酸乙酯、二甲亚砜为色谱纯级；乙酸铵、磷酸二氢钾为优级纯；2-硝基苯甲醛为色谱纯级，使用前称取75.6 mg溶于10 mL二甲亚砜中，现配现用；实验用水取自Milli-Q超纯水系统(Millipore公司)。

1.2 标准品与标准曲线

标准品包括5-甲基吗琳-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙丙酰脲(AHD)、3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)和氨基脲(SEM)，均为德国Dr.Ehrenstorfer公司产品，纯度≥ 99%。

内标物包括5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素内标物AMOZ-D5、1-氨基-2-内酰脲的同位素内标物AHD-13C3、3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素内标物AOZ-D4、氨基脲的同位素内标物SEM-13C-15N2，均为德国Witega公司产品，纯度≥ 99%。

标准溶液的配制：准确称取4种标准品，用甲醇溶解，并定容配制成50 mg/L的标准储备液，4 ℃冷藏保存，保存期为6个月。准确量取标准储备液，用甲醇逐级稀释配制成50和5 ng/mL混合标准工作液。准确量取内标标准储备液，用甲醇逐级稀释配置成50 ng/mL混合内标标准工作液。

1.3 样品前处理

1.3.1衍生化

养殖水和底泥预先除去杂质，底泥在阴凉处自然风干，磨碎过20目筛。分别准确量取10 mL水和称取2 g底泥加入50 mL离心管中，加入100 μL混合内标物，涡旋1 min。再加入5 mL盐酸溶液和300 μL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋1 min，充分混合均匀。置于恒温水浴振荡器中，避光水浴振荡，分别设置37、50、60和80 ℃ 4种水浴温度，振荡时间分别设置为1、2、4、8和16 h，其中37 ℃下仅设置振荡16 h。

1.3.2 提取与净化

取出离心管冷却至室温，加入适量(约8～10 mL)磷酸二氢钾溶液，混合均匀，调节pH至7.0。加入10 mL乙酸乙酯，涡旋2 min后，6 000 r/min离心5 min，取上层乙酸乙酯，然后重复提取1次，合并上层乙酸乙酯在40 ℃下氮吹至干。使用1 mL初始流动相定容，过0.2 μm有机滤膜后待测。

1.4 标准工作曲线的制作

分别准确移取5 ng/mL混合标准溶液50、100、200 μL于3个离心管中，分别准确移取50 ng/mL混合标准溶液50、100、200 μL于3个离心管中，在这6个离心管中分别加入50 ng/mL混合内标标准工作液100 μL。衍生过程参照1.3.1进行，提取与净化参照1.3.2进行。最后标准工作曲线浓度依次为0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，内标浓度为5 ng/mL。

1.5 色谱、质谱条件

色谱条件：实验所使用色谱柱为安捷伦 Zobax Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；流动相为乙腈和乙酸铵甲酸溶液，乙酸铵浓度为2 mmoL/L，甲酸含量为0.1%；流动相流速为0.2 mL/min；进样量为5 μL。梯度洗脱条件见表1，其中A为水相，B为有机相。

表1 流动相梯度洗脱程序

Tab.1 Elution process of the separation

时间Time体积分数/%VolumefractionφAφB0．0090100．7590104．0030704．5010904．5110905．009010

注：A为2 mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)；B为乙腈。

质谱参数(ESI)：干燥气温度(gas temperature)为350 ℃，干燥气流量(gas flow)为11 mL/min，毛细管电压(capillary)为4 000 V，多反应监测，具体参数见表2。

1.6 回收率的测定

4种硝基呋喃代谢物设置0.5、2.0、5.0 μL 3个添加浓度水平，按照1.3进行样品前处理，采用1.5色谱质谱条件进行测定，以峰面积定量，计算回收率和标准偏差。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

为了获得目标化合物较高的响应值，需要在较高浓度条件下优化要测定的目标药物的质谱条件。4种硝基呋喃代谢物采用浓度10 ng/mL的单标溶液，37 ℃恒温振荡16 h衍生化后进行。首先，通过全扫描模式确定各个药物的母离子的质荷比，然后通过子离子扫描确定定量和定性子离子的质荷比，根据确定的母离子和子离子选择最佳传输电压和碰撞能量，最后再进行其他参数的优化。最终确定的最佳质谱条件见表2，标准工作液的质谱图见图1。

2.2 色谱条件的优化

实验中发现，在流动相中加入甲酸不仅可以改善各组分的峰型，还可以提高离子化的效率。因此，本研究所使用的流动相为乙腈和乙酸铵甲酸溶液，其中乙酸铵浓度为2 mmoL/L，甲酸含量为0.1%。流动相流速过大会降低离子化效率，过低又会延长分析时间，且本研究中采用的色谱柱为短柱子，故综合考虑确定采用0.2 mL/min作为流动相的流速。

图1 硝基呋喃代谢物标准工作液质谱图A、B、C、D分别表示AMOZ、SEM、 AHD、 AOZ标准工作溶液质谱图。每排左、中、右图分别表示定量离子质谱图、子离子丰度比和子离子质荷比。Fig.1 Mass spectra of nitrofuran metabolites standard working solutionA, B, C, D respectively showed AMOZ, SEM, AHD, AOZ mass spectrogram. The left, middle and right figures in every row respectively showed quantitative ion mass spectra, product ion abundance ratio and ratio product ion mass-to-charge ratio.

表2 4种硝基呋喃代谢物的质谱参数

Tab.2 Mass spectrometry parameters for four nitrofuran metabolites

化合物母离子子离子传输电压/V碰撞能量/eVCompoundParentionProductionFragmentCollisionenergyAMOZ335291∗112810011230AMOZ-D53402961128AHD249134∗1121010411222AHD-13C325213412814AOZ236134∗11091048026AOZ-D42401341288SEM209192∗1121313011222SEM-13C-15N22129211218

注：标*的子离子为定量离子。

与液相色谱法相比，超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱联用法不需要目标物完全获得分离，采用表1中流动相梯度洗脱条件，虽然不能很好分离目标化合物，但是4个目标物的保留时间均在4 min以内(图2)，如果 4 min 后马上将流动相回复至初始比例，会导致样品中部分杂质残留在色谱柱中，使基线噪音增加、保留时间重现性变差以及灵敏度降低。因此，本研究在4 min之后继续将有机相的比例提高至90%，然后再将流动相比例恢复至初始比例。采用表1的梯度洗脱条件和0.2 mL/min流动相流速，可以在很短时间内就能完成一次样品的检测，节省了时间成本，并减少了有机试剂的使用。

图2 硝基呋喃代谢物标准工作液总离子流图Fig.2 The TIC of nitrofuranmetabolites standard working solution

2.3 衍生化条件的优化

本研究主要探讨了衍生化温度以及衍生时间对硝基呋喃代谢物残留测定的影响。选择37 ℃恒温振荡16 h衍生化作为参考，对另外几种温度和时间的衍生效果进行比较(表3)。从结果可以看出，在相同衍生时间下，随着温度的提高衍生效率提高，但是在80 ℃时，效率降低，通过比较发现，60 ℃衍生化的效果最好，因此，选择60 ℃作为本研究的衍生化温度。在60 ℃条件下进行衍生化，随着时间增加，效果提高，但是在4 h后衍生化效果基本保持不变。综上，本研究采用60 ℃恒温振荡4 h作为养殖水和底泥中硝基呋喃代谢物的衍生化条件。

表3 不同衍生温度和时间条件下4种硝基呋喃代谢物峰面积

Tab.3 The peak areas of 4 derivative compounds at differernt temperature and time of derivative reactions

n=3

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性关系、检出限和定量限

分别移取适量混合标准溶液，并加入适量内标混合溶液，按照上述方法操作，使最终溶液的质量浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，混合内标浓度为5 ng/mL。内标法定量，做线性回归分析并绘制校准曲线，结果见表4。分别在空白水样和底泥样品中添加4种待测组分，信噪比(S/N)为3时计算检出限 ( LOD )，S/N为10时计算定量限 (LOQ)，4种硝基呋喃代谢物的LOD和 LOQ见表4。

2.4.2 回收率和精密度

用不含4种待测组分的水样和底泥进行加标回收率和精密度实验，样品前处理同1.3 节。选取0.5、2.0、5.0 ng/mL(g)作为添加量，每个添加水平进行3次重复实验，计算回收率与相对标准偏差(RSD)，结果见表 5。从表5可以看出，在3个添加水平，养殖水中4种硝基呋喃代谢物的回收率范围为91.3%～102.2%，相对标准偏差范围为1.4%～7.5%，底泥中4种硝基呋喃代谢物的回收率范围为92.3%～101.3%，相对标准偏差范围为2.7%～7.6%。可以看出，该方法可以满足养殖水和底泥中4种硝基呋喃代谢物残留的检测。

表4 硝基呋喃代谢物检测方法的工作曲线、检出限和定量限

Tab.4 The linear regression equations, LOD and LOQ of the detection method for nitrofuran metabolites

化合物Compound线性方程Linerrange相关系数Correlationcoefficients检出限/[ng·mL-1(g)-1]LOD定量限/[ng·mL-1(g)-1]LOQAMOZY=1．089194x+0．0059830．99990．10．25SEMY=0．697087x+0．1862990．99750．10．25AHDY=1．919787x-0．0899170．99980．10．25AOZY=0．792944x+0．0127930．99970．10．25

表5 养殖水和底泥中4种硝基呋喃代谢物加标回收率和精密度

Tab.5 Recoveries and relative standard deviation of the detection method in water and sediment for four nitrofuran metabolites

n=3

化合物Compound添加浓度/[ng·mL-1(g-1)]Spikedconcentrtion养殖水Water底泥Sediment回收率/%Recovery相对偏差/%RSD回收率/%Recovery相对偏差/%RSDAMOZ0．595．33．292．37．62．095．82．993．36．25．099．01．896．23．6SEM0．590．75．692．34．32．092．53．4923．95．095．32．7101．32．7AHD0．596．07．5935．72．095．71．896．23．55．099．3199．33．6AOZ0．591．3793．58．62．0102．22．794．73．75．099．11．496．74．1

3 结论

本研究建立了超高压液相色谱串联质谱检测养殖水和底泥中4种硝基呋喃代谢物残留的方法。该方法检出限为0.1 ng/mL(g)，定量限为0.25 ng/mL(g)，在0.25～10 ng/mL(g) 范围线性关系良好，回收率范围为91.3%～102.2%，相对标准偏差均小于10%。该方法具有重复性好、灵敏度高、简便、准确、快速的优点，可以在短时间内对养殖水和底泥中4种硝基呋喃代谢物进行准确的定性和定量，能够满足渔业养殖环境中硝基呋喃类药物残留的监控要求。

[1] Van Koten-Vernelen J E M．Report of the 40th Meeting of the JECFA World Health Organization [R]. Geneva: JECFA, 1993, 85: 85-90．

[2] 王群，吕海燕，宋怿. 硝基呋喃类在水产品及其养殖环境中消解规律的研究[J]. 中国渔业质量与标准，2014,4(6)：16-20.

[3] 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国农业部公告第235号[EB/OL].(2002-12-24)[2016-03-04]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/nybz/200803/t20080304_1028649.htm.

[4] 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国农业部公告第560号[EB/OL].(2005-10-28)[2016-04-01]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117_496523.htm.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 关于印发《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)》的通知[EB/OL]. (2010-03-23) [2016-04-08]. http://www.moh.gov.cn/zwgkzt/pwsjd1/201004/46534.shtml.

[6] 杨楠，赵晶，权伍英，等. 液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物[J]. 中国卫生检验杂志，2008, 18(6)：978-980.

[7] Law F C, Meng J. Binding of14C-furazolidone metabolites to the muscular and hepatic proteins of trout [J]. Food Addit Contam, 1996, 13(2): 199-209.

[8] 曾春芳，万译文，李小玲，等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品硝基呋喃类代谢物残留[J]. 湖南师范大学(自然科学学报), 2013, 36(5): 45-50.

[9] Delatour T，Gremaud E，Mottier P，et al．Preparation of stable isotope-labeled 2-nitrobenzaldehyde derivatives of four metabolites of nitrofuran antibiotics and their comprehensive characterization by UV, MS, and NMR and techniques [J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(22):6371-6379.

[10] 孙言春，张洁，牟振波，等. 固相萃取液相色谱串联质谱测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留研究[J]. 中国渔业质量与标准, 2011, 1(2):54-59.

[11] 邢丽红，孙伟红，李兆新，等. 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物[J]. 环境化学, 2011, 30(6):1202-1203.

[12] 丁磊, 蒋俊树, 顾亮, 等. 高效液相色谱串联质谱法快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物研究[J]. 现代农业科技, 2010, 11:336-337, 345.

[13] 刘四新, 胡先娥, 林正峰, 等. 液相色谱串联质谱法检测水产品硝基呋喃类代谢物的改进[J]. 食品科学, 2009, 30(20): 331-335.

[14] 沈美芳，宋红波，耿雪冰，等. 酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留[J]. 水产学报, 2006, 30(4): 520-524.

[15] 张林田，黄少玉，陈建伟，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物[J].理化检验-化学分册， 2009, 45(11)：1311-1314.

[16] Claudia B，Petra G，Carolin S. Matrix-com-prehensive in-house validation and robustness check of a confirm-atory method for the determination off our nitrofuran metabolites in poultry muscle and shrimp by LC -MS/MS [J]. J Chrom B， 2007，856：178-189.

[17] 中华人民共和国农业部．农业部783号公告-1-2006 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法[S]. 北京:中国标准出版社，2006.

[18] 徐英江，宫向红，田秀慧，等. UPLC MS/MS测定海水及沉积物中硝基呋喃类代谢物[J]. 环境化学，2009，28 (4): 137-138.

[19] 李冰，黄宣运，蔡友琼，等. 高效液相色谱串联质谱法测定水体中氨基脲、5-甲基吗啉-3-氨基 -2- 恶唑烷基酮、1-氨基乙内酰脲和3-氨基-2-唑烷基酮[J]. 分析试验室， 2013，32(6):24-29.

[20] 陈永平，张素青，李春青，等. 液质质串联质谱法测定淡水及沉积物中硝基呋喃类代谢物[J]. 河北渔业，2015(9):50-57.

[21] 尹怡，潘宇，刘书贵，等. 超声辅助衍生-液相色谱/串联质谱法快速测定养殖水体中硝基呋喃类代谢物的残留量[J].分析实验室, 2015, 34(4):416-120.

Determination of nitrofuran metabolites in fisheries environment by ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

CHENG Qiang, CHEN Jingdu*, WU Hongjun, WANG Longgen

(Yangzhou City Agricultural Products Quality Supervision and Inspection Center, Yangzhou 225101, China)

A rapid method based on ultrasound assisted derivatization (UAD) with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was proposed for determination of 4 nitrofuran metabolite residues in fisheries water and sediment. It was determined that 2-nitrobenzaldehyde was used as a derivating agent. The sample was derived after 60 ℃ oscillation for 4 h. It was then extracted by ethylacetate and separated by a C18column. It was confirmed by multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization source using internal standard method. Under the optimized extraction conditions, the limits of detection (LODs) for the derivatized nitrofuran metabolites were 0.1 ng/mL and the limits of quantification (LOQs ) were 0.25 ng/mL (g). Good linearities were obtained over the range of 0.25～10 ng/mL (g). The satisfactory recoveries for the blank water samples at three spiked levels (0.5, 2.0 and 5.0 ng/mL (g)) ranged from 91.3% to 102.2%, with all relative standard deviations under 10%. The method is proved to be fast and effective for simultaneously qualitative and quantitative inspection of the metabolites of nitrofuran in fisheries environment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(4):37-43]

nitrofuran metabolites; derivatization temperature; fisheries environment; sediment; UPLC-MS/MS

CHEN Jingdu, chenjingdu1985@163.com

2016-01-22；接收日期：2016-03-18

扬州市绿扬金凤计划资助(扬人才办[2014]5号)

成强(1972-)，男，硕士，研究员级高级工程师，研究方向为水产品药物代谢动力学与质量安全，614037373@qq.com 通信作者：陈京都，博士，农艺师，研究方向为农产品药物残留检测技术，chenjingdu1985@163.com

S94；O657.63

A

2095-1833(2016)04-0037-07